細胞體外暴露染毒技術的發(fā)展與展望

一、簡介：

不斷進行的工業(yè)發(fā)展和新技術改進應用（例如，納米技術），都導致了空氣污染的不斷增加，導致了肺部疾病在過去幾十年里大大的增加。新的產品（例如，納米粒子的噴霧劑）已經被廣泛應用在電氣工業(yè)，日常消費和醫(yī)療應用等等特別是噴霧或粉末形式應用的產品，對人體健康被認為是特別有害的。由于增加了有害物質的釋放，如，當使用納米噴霧劑的鞋護理，清潔劑，抗菌噴霧劑，或在塑料等產品的技術加工過程，也就明顯增加肺部暴露機會。然而，對可吸入物質的毒性及基本病理機制的研究卻了解甚少。自2006以來，歐盟化學品監(jiān)管規(guī)定（注冊，評估，授權和限制化學品，歐共體1907 / 2006），要求對現(xiàn)有的以及新推出的化學品進行毒性風險評估，包括鑒定其潛在的吸入毒性危害。人體內的毒理學數(shù)據(jù)是罕見的，因為人類中毒通常是偶然的，不可預測的，和不可控制的。具有相同或類似的實驗標本數(shù)據(jù)是非常困難的。此外，社會道德的原因，在人體內開展肺毒性的研究也是不可行的。因此，毒理學數(shù)據(jù)通常在動物實驗中產生。然而，動物模型也具有其局限性，例如種間差異。此外，立法需要考慮“3R”原則（減少，優(yōu)化，和替代）及其發(fā)展，即需建立和驗證可替代目前動物試驗的方法。因此，一種以體外實驗為基礎的體外暴露染毒技術，進行肺毒理性評價研究是必須的。

二、細胞體外暴露染毒技術

1. 浸沒式體外暴露染毒

各種體外培養(yǎng)模型已經被用來進行空氣中氣溶膠的急性毒性評價與研究。傳統(tǒng)浸沒式體外暴露染毒技術，是最簡單有效的一種體外暴露染毒研究方法，到目前為止，仍有許多實驗室正在使用。該方法首先是把細胞進行浸沒式培養(yǎng)，然后把需要暴露的氣溶膠物質需溶于培養(yǎng)液后到達細胞表面，通過細胞與培養(yǎng)液相互作用的方式進行進行染毒實驗（如圖1所示）。

圖1 浸沒式體外暴露染毒模式圖

但是，對于肺內上皮細胞，這種方式有別于真實的氣液界面暴露環(huán)境：1、暴露在浸沒條件下進行，導致氣溶膠特性存在潛在改變的可能；2、對于不溶于水的固體顆粒物，其在培養(yǎng)液中分布的均勻性較低；3、相比較于氣體，顆粒物在液體中的運動速度降低，與細胞接觸的效率降低。

2. 氣液界面體外暴露染毒

由于浸沒式體外暴露然染毒存在先天的缺陷，科學家們開始探索一種新的能夠更加真實模擬體內生物效應的體外暴露染毒技術。早在1975年，Voisin等人提出的氣液界面體外暴露染毒（ALI）的描述，這一描述為體外培養(yǎng)肺細胞的氣液界面暴露（ALI）提供了依據(jù)。這一理論中細胞既可以通過底膜獲取培養(yǎng)基，保證了細胞的體外存活率，又可實現(xiàn)與頂部與氣體（含受試物質氣溶膠）直接暴露。

圖2  氣液界面體外暴露染毒模式圖

2.1 第一代氣液界面細胞暴露染毒裝置CULTEX：1999年，根據(jù)Voisin等人的描述和Tarkington等人關于動態(tài)暴露染毒的概念，德國漢諾威醫(yī)學院毒理學教授Dr. Ulrich Mohr、Dr. Michaela Aufderheide等人，成功開發(fā)了第一代體外細胞培養(yǎng)與暴露的染毒的裝置，即基于線性流的體外暴露染毒模塊Cultex CG（如 圖3）

圖3 CULTEX CG  (線性流體外暴露染毒系統(tǒng)Linear Flow System)

第一代氣液界面體外暴露染毒系統(tǒng)，主要特點是氣路呈線性流分布。主要結構有上下兩個模塊，兩模塊形成緊密的封閉系統(tǒng)。其中下部模塊為細胞培養(yǎng)部分，實驗室細胞培養(yǎng)小室置于其中，小室底部具備37℃水浴及可流動的培養(yǎng)基供給；上部是與培養(yǎng)小室對應分布的線性的氣體進出模塊，通過在后端連接的抽氣泵，在密閉腔室內實現(xiàn)負壓，所需暴露物質不停進入密閉系統(tǒng)內完成暴露染毒后才從后端排出。細胞培養(yǎng)小室中形成良好的細胞培養(yǎng)環(huán)境，其中的細胞并可與頂部進來的氣體進行直接接觸，實現(xiàn)直接的氣液界面暴露。

2.2 第二代氣液界面細胞暴露染毒裝置CULTEX RFS：

在受試物為氣體時，氣路設計是否為線性排列，并不重要，因為，氣體的分布是均勻的。但當受試物為顆粒物氣溶膠時，由于其具有復雜顆粒物粒徑大小分布及物理化學性質，其線性方向運輸將對其顆粒物的沉積產生非常大的影響。（1）顆粒物濃度及粒徑分布在稀釋系統(tǒng)中的穩(wěn)定性收到影響；（2）在不同的細胞小室上沉積的粒子濃度及粒徑將發(fā)生變化，導致在不同的細胞小室內沉積顆粒的平行性和重復性較差。顯然，壓縮空氣的進氣稀釋是無法打破受試物質的層流分布，這將無法改變如上所述沉積效應的產生。

考慮到這些缺點，細胞培養(yǎng)小室和氣溶膠入口分布需要進行根本性的改變。為了避免受試顆粒物暴露的不均勻性，Cultex推出全新概念的二代暴露染毒模塊Cultex RFS（圖4、圖5）。

  圖4  CULTEX  RFS外觀圖            圖5  CULTEX  RFS內部氣路圖

在這里，氣溶膠將通過一個帶有噴嘴(Mohr, 2013)的中央入口統(tǒng)一進入，在噴嘴處氣溶膠將均勻分散到三個中央輻射分布的通道內，通過該通道進入輻射分布的細胞培養(yǎng)室內，如此過程后，氣溶膠在三個細胞小室內沉積的均一性和重復將大大提高。該實驗中不同顆粒沉積后的圖片和數(shù)據(jù)結果都顯示了非常好的效果，三個細胞小室間顆粒沉積偏差和標準偏差都非常理想。與第一代線性流系統(tǒng)比較，我們發(fā)現(xiàn)二代輻射流暴露染毒模塊損失了部分顆粒，即每個細胞小室內沉積顆粒總質量在減少。這是由于Cultex RFS模塊中我們增加了大顆粒物（凝聚粒子）預分離技術，降低了大的或凝聚在一起的顆粒沉積到細胞表面的可能，即提供了顆粒物粒徑分布的均一性，使實驗受試物更穩(wěn)定，既減小了粗顆粒對實驗的影響，又進一步提高了實驗重復性和穩(wěn)定性。

2.3 第三代氣液界面細胞暴露染毒裝置CULTEX RFS COMPACT：

圖6  COMPACT結構圖

氣液界面細胞暴露染毒發(fā)展到第二代技術CULTEX RFS，已經具有非常高的實驗重復性和穩(wěn)定性，但在實際應用中仍有一些問題，比如通道數(shù)量較少，只有3個暴露通道，且所有通道暴露同一氣溶膠物質，缺少對照實驗組。為此德國CULTEX實驗室技術公司在2015年推出第三代氣液界面細胞暴露染毒裝置CULTEX RFS COMPACT（見圖6），COMPACT繼承了CULTEX RFS的輻射流設計等主要優(yōu)點外，增加了細胞暴露腔室數(shù)量達6個，共分為兩組，進行對比試驗。同時優(yōu)化減少了每個腔室細胞培養(yǎng)基加入量，整體采用電加熱恒溫系統(tǒng)，更靈巧便捷，易于進行室外大氣試驗。

這便是氣液界面細胞暴露染毒技術的發(fā)展過程，在早期主要是細胞系（如A549）以及原代細胞（如巨噬細胞）被用于在急性吸入毒理學領域的劑量-反應關系的建立。隨著時間的推移，體外暴露染毒系統(tǒng)已經變得越來越復雜，現(xiàn)在已經可以用于對呼吸道不同部位分化培養(yǎng)的3D細胞進行體外暴露染毒研究，特別是近期CULTEX推出的Insert Cup裝置，可以很好的在體外建立細胞共培養(yǎng)模型。CULTEX復雜的體外暴露染毒系統(tǒng)的發(fā)展也為毒理學測試策略開辟了新的領域。除了在急性吸入毒理學領域已經形成穩(wěn)定的驗證方法外，多次重復體外暴露染毒概念，特別是無毒劑量實驗已經在亞急性試驗領域得到開展。

目前，體外暴露染毒技術的主要興趣是：在體外更真實的模擬人類體內的生物效應，開展各種指定實驗物質的體外暴露染毒實驗。