PCR技術(shù)的發(fā)展（下）

接著上期，我們繼續(xù)回到故事里面。

關(guān)于Mullis發(fā)現(xiàn)PCR的過程，比較公認(rèn)的版本是，有一天他駕車開過蜿蜒山路的時(shí)候，開始琢磨他的檢測單堿基突變的方法。這一次他想到的點(diǎn)子是，既然結(jié)合一條引物是可行的，為什么不試試看同時(shí)結(jié)合兩條引物呢。于是Mullis開始在腦海里模擬這個(gè)實(shí)驗(yàn)：設(shè)計(jì)兩條引物，分別結(jié)合在DNA的正義鏈和反義鏈上，且這兩條引物的3’端均位于待測堿基的上游1個(gè)堿基的位置。這樣，當(dāng)進(jìn)行Oligomer Restriction檢驗(yàn)的時(shí)候，兩條鏈上都會(huì)延伸結(jié)合上相應(yīng)的ddNTP。只需要在原先設(shè)計(jì)引物的時(shí)候?qū)�兩個(gè)引物的長度設(shè)計(jì)得不一樣，得到的兩個(gè)產(chǎn)物就能夠在DNA膠上被區(qū)分開來。這樣，一次檢測就能同時(shí)得到兩個(gè)結(jié)果，這兩個(gè)結(jié)果可以互為對(duì)照組，如果兩條鏈的結(jié)果得到的堿基可以互相配對(duì)成功，那么證明實(shí)驗(yàn)體系沒有問題，結(jié)果可信；反之，如果兩條鏈結(jié)果不一致，那么很有可能是實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)了問題。

Mullis開始模擬實(shí)驗(yàn)：如果混入了dNTP，那么聚合酶在延伸DNA鏈時(shí)則會(huì)有時(shí)用dNTP有時(shí)用ddNTP，使得ddNTP結(jié)合的位置就變得不確定，通過他的對(duì)照組的設(shè)計(jì)就能夠檢測出來，該組實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能采信。很好，對(duì)照組的效果不錯(cuò)。那么，有沒有什么辦法可以避免dNTP的混入呢？比如用堿性磷酸酶（BAP,Bacteria Alkaline Phosphate）呢？用BAP除去原有混合物里面的磷酸基團(tuán)，隨后再加入ddNTP開始反應(yīng)，這樣應(yīng)該不錯(cuò)。不過得想個(gè)辦法在加入ddNTP之前除去BAP的活性。

由于一時(shí)想不到好的解決辦法，于是Mullis便開始想，那么就先這樣吧，讓那些混入的dNTP先留 在反應(yīng)體系里面，看看會(huì)發(fā)生什么事。于是，在那條漫長的公路上，他又開始繼續(xù)他的思維模擬實(shí)驗(yàn)。這一次，他碰到了真理——PCR。當(dāng)Mullis繼續(xù)想著他的模擬實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，他距離真理已經(jīng)越來越近了。如果原先的反應(yīng)體系里面混有dNTP，那么不妨先加入DNA聚合酶讓反應(yīng)發(fā)生，這時(shí)dNTP就會(huì)被作為原料完成DNA復(fù)制的反應(yīng)；而此時(shí)只需要加熱使DNA雙鏈變性，再冷卻復(fù)性時(shí)由于引物的量很多，因此原來的DNA鏈與引物結(jié)合的可能性最大，這樣就達(dá)到了去除dNTP的目的。但是，如果dNTP的量比較多，延伸得比較長，使得變性復(fù)性之后，新合成的鏈與下游的反向引物結(jié)合了呢？  

EUREKA（找到了）！這樣也沒有關(guān)系，不就是模板鏈加倍了嗎！單堿基突變檢測照常進(jìn)行！那么我可以有意多加引物保證模板鏈復(fù)制以提高效率！如果像這樣一遍一遍重復(fù)，那么模板DNA就可以不斷復(fù)制擴(kuò)增了！單堿基檢測的效率就大大提高了！

于是Mullis開始給Cetus其他的科學(xué)家們講他的想法，但是除了他的女友Jennifer以及為數(shù)不多的幾個(gè)技術(shù)員之外，其余的人都對(duì)他的想法并不感興趣。不過同時(shí)，他的同事們也并不能從他的設(shè)計(jì)里面挑出任何漏洞。也就意味著，很有可能方案可行。

接下來就是實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了，在實(shí)驗(yàn)中他也經(jīng)歷了一些挫折。終于在1984年Mullis和Cetus公司對(duì)于PCR技術(shù)申請(qǐng)了技術(shù)專利，并且撰寫了文章發(fā)表。由公司撰寫的關(guān)于PCR技術(shù)應(yīng)用的文章很快在Science上刊發(fā)，但是由于種種原因，Mullis撰寫的PCR原理的文章先后被nature和Science拒絕，最后只能發(fā)表在不知名的Methods of Enzymology （《酶學(xué)方法》）雜志上（真是天大的遺憾啊，估計(jì)此時(shí)nature和Science腸子都悔青了�。�。

寫到最后，回顧PCR發(fā)明的科學(xué)歷程，還是非常有趣的。通常我們研究一個(gè)科學(xué)問題的思路，是提出一個(gè)重大的科學(xué)問題（Question），找到一個(gè)適合的研究體系（System），并借助于相關(guān)的技術(shù)（Technique）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探索與猜想驗(yàn)證。如果不是這個(gè)思維極度發(fā)散，同時(shí)又善于抓住重要問題的“科學(xué)怪才”，即便是好點(diǎn)子送上們來也只怕會(huì)擦肩而過了。