使用SpectraMax微孔板讀板機(jī)檢測(cè)Quant-iT PicoGreen dsDNA實(shí)驗(yàn)

簡(jiǎn)介

雙鏈DNA通常使用微孔板讀板機(jī)通過(guò)測(cè)量DNA溶液的260nm吸收光進(jìn)行定量。然而，這種方法通常在微孔板讀板機(jī)上只能檢測(cè)到最低250ng/mL的濃度。對(duì)于生物學(xué)應(yīng)用涉及到小體積樣品，如新一代測(cè)序和擴(kuò)增產(chǎn)物定量時(shí)，更靈敏的方法才能滿足需求。Life Technologies公司的Quant-iT PicoGreen dsDNA實(shí)驗(yàn)對(duì)于DNA的特異性更好且比傳統(tǒng)的吸收光方法靈敏1000倍。產(chǎn)品信息中標(biāo)稱在微孔板上進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)，使用單一染料濃度時(shí)動(dòng)態(tài)區(qū)間可達(dá)250pg/mL到1000ng/mL。1此篇應(yīng)用文章展示使用Molecular Devices公司SpectraMax®熒光微孔板讀板機(jī)和Quant-iT PicoGreen實(shí)驗(yàn)，用戶能穩(wěn)定的檢測(cè)低至100pg/mL的雙鏈DNA。

為了最大化實(shí)驗(yàn)的靈敏度，使用最優(yōu)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)是必要的。不像基于濾色片的讀板機(jī)，SpectraMax微孔板讀板機(jī)的雙光柵允許用戶選擇儀器標(biāo)稱范圍內(nèi)任意波長(zhǎng)。確定能產(chǎn)生最佳實(shí)驗(yàn)動(dòng)態(tài)區(qū)間的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)是很重要的，因?yàn)檫@會(huì)與基于濾色片的讀板機(jī)有一定區(qū)別。

SpectraMax M5熒光微孔板讀板機(jī)的最優(yōu)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)如下：490nm激發(fā)和525nm發(fā)射，515nm發(fā)射截取濾色片(注意這些波長(zhǎng)可能與Quant-iT PicoGreen產(chǎn)品說(shuō)明書中針對(duì)基于濾色片讀板機(jī)的波長(zhǎng)有所不同)。SoftMax®Pro軟件中有預(yù)設(shè)程序用來(lái)獲取，展示和分析來(lái)自SpectraMax系列讀板機(jī)的數(shù)據(jù)。

優(yōu)勢(shì)

- 靈敏的熒光定量低至 63 pg/mL的DNA
- 線性動(dòng)態(tài)范圍跨四個(gè)數(shù)量級(jí)
- 通過(guò)SoftMax Pro軟件中預(yù)設(shè)的程序簡(jiǎn)單的分析結(jié)果

材料

- Quant-iT PicoGreen dsDNA實(shí)驗(yàn)試劑盒，包含l ambda DNA標(biāo)準(zhǔn)品(Life Technologies 貨號(hào) #P7589或P11496)
- 褐色96-孔板(Greiner Bio-One, 貨號(hào)#655096)
- 棕色或琥珀色 (避光離心管）
- Molecular Devices 帶熒光檢測(cè)模式的微孔板讀板機(jī):
- S pectraMax® M3/M4/M5/M5e(cat. #M3 or #M4 or #M5 or M5E)
- SpectraMax® i3x (cat. #i3x)
- S pectraMax® M2/M2e(cat. #M2 or M2E)
- Gemini XPS/EM (cat. #XPS or EM)
- FlexStation® 3 (cat. #FLEX3)
- FilterMax F3/F5 (cat. #F3 or F5)
- S pectraMax® Paradigm(cat. #PARADIGM)
- SoftMax® Pro軟件(Molecular Devices)

方法

儀器設(shè)置

- 將微孔板讀板機(jī)開機(jī)。
- 啟動(dòng)SoftMax Pro軟件并在Protocols下拉菜單中打開 PicoGreen熒光程序。 針對(duì)實(shí)驗(yàn)最優(yōu)的設(shè)置已包含在程序中(見Table 1)。通過(guò)點(diǎn)擊“Settings”并在屏幕左側(cè)選擇需要讀取的孔并和實(shí)驗(yàn)板類型。
- 點(diǎn)擊“Template”按鈕來(lái)打開窗口，在窗口中您可以分配多孔板的孔到預(yù)設(shè)模板的相應(yīng)組中。 可以使用下拉菜單來(lái)選擇合適的模板組。熒光程序中有多個(gè)預(yù)設(shè)的模板組，包含Standards,Unknowns,和Unknowns_NoDiln (對(duì)應(yīng)稀釋的樣品)。分配孔到當(dāng)前模板的組中會(huì)將程序組表格中所對(duì)應(yīng)的微孔板讀取時(shí)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分組。

準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法遵循QuantiT PicoGreen dsDNA試劑和試劑盒中產(chǎn)品信息頁(yè)中的指導(dǎo)，除了實(shí)驗(yàn)體積按比例從2.0mL減到200μL來(lái)適應(yīng)96孔微孔板格式。

- 通過(guò)使用無(wú)DNA酶水20倍稀釋試劑盒中的濃縮緩沖液制備1XTE緩沖液(10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH7.5)。
- 使用TE緩沖液(上面制備的)200倍稀釋濃縮的Quant-iT PicoGreen試劑DMSO溶液來(lái)制備水相工作液。推薦在塑料容器中而不是在玻璃容器中制備此溶液，因?yàn)樵噭┯锌赡芪�附在玻璃表面上。通過(guò)使用琥珀色或棕色管或用金屬箔包裹將試劑避光。應(yīng)在試劑制備后幾小時(shí)內(nèi)使用。
- DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線：用TE緩沖液制備2μg/mLdsDNA儲(chǔ)液。試劑盒中提供的ambdaDNA標(biāo)準(zhǔn)品可以通過(guò)使用TE稀釋50倍來(lái)制成2μg/mL溶液。

注意：某些情況下可能需要使用和待測(cè)DNA相似的DNA類型制作標(biāo)曲

- 高濃度范圍標(biāo)曲可以濃度從1 ng/mL制備到1 μg/mL，低濃度范圍標(biāo)曲可以從25 pg/mL制備到25 ng/mL。對(duì)于高濃度范圍標(biāo)曲，按Table 2中稀釋方案稀釋；對(duì)于低濃度范圍標(biāo)曲，40倍稀釋2μg/mL溶液制備50 ng/mL溶液，參考Table 3中的稀釋方案。 注意：此篇應(yīng)用文檔，使用了濃度從1 μg/mL到50pg/mL的一系列標(biāo)曲。
- 用移液器將100 μL每孔標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移到一個(gè)黑色 96-孔微孔板中，最好3個(gè)重復(fù)。確保向孔中加TE(無(wú)DNA)來(lái)作為空白孔。
- 加100 μL每孔Quant-iT PicoGreen試劑水相工作液。通過(guò)渦旋或震板機(jī)室溫避光混合2到5分鐘。

讀取微孔板

- 確保紫色板子適配器(如果您的讀板機(jī)需要的話)放入微孔板讀板機(jī)的板托中。
- 點(diǎn)擊SoftMax Pro軟件中的Read按鈕。儀器會(huì)讀取板子并且相對(duì)熒光單位會(huì)顯示在程序的板子區(qū)塊中。

分析數(shù)據(jù)

- 微孔板讀取之后，相對(duì)熒光單位 (RFUs)會(huì)被顯示在板子區(qū)塊中。模板建立設(shè)定的組表格中的數(shù)據(jù)會(huì)被分析。一套有代表性的組表格中的數(shù)據(jù)，見Table 4結(jié)果區(qū)塊。
- 模板中分配指定的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)在程序中標(biāo)準(zhǔn)曲線區(qū)塊被自動(dòng)擬合成曲線(并顯示在標(biāo)準(zhǔn)品組表格中)。默認(rèn)設(shè)置是線性曲線擬合，但是擬合寬范圍標(biāo)曲時(shí)可使用loglog曲線擬合�？稍谇�線圖區(qū)曲線擬合下拉菜單中選擇曲線擬合。

結(jié)果

使用Quant-iT PicoGreen dsDNA實(shí)驗(yàn)和SpectraMax? M5 微孔板讀板機(jī)測(cè)定濃度從1μg/mL到50 pg/mL的DNA標(biāo)準(zhǔn)品(MolecularDevices 公司其他熒光微孔板讀板機(jī)會(huì)得到相似結(jié)果)。SoftMax® Pro軟件會(huì)對(duì)每組標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)自動(dòng)化校準(zhǔn)并計(jì)算平均RFU，標(biāo)準(zhǔn)偏差，和%CV。使用SoftMax Pro軟件loglog曲線擬合方式擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線 (見Figure 1.)使用96孔板微孔板格式觀察到的靈敏度低至63 pg/mL并且標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)限通過(guò)孔板三倍標(biāo)準(zhǔn)偏差值校準(zhǔn)。這數(shù)值明顯低于QuantiT PicoGreen實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品說(shuō)明書中標(biāo)稱的250 pg/mL。Figure 2展示了低濃度端標(biāo)準(zhǔn)曲線。整個(gè)標(biāo)曲范圍的線性都非常好。

結(jié)論

Quant-iT PicoGreen dsDNA 實(shí)驗(yàn)，當(dāng)在使用SoftMax Pro軟件的SpectraMax微孔板讀板機(jī)上檢測(cè)時(shí)，是一種對(duì)于雙鏈DNA快速，靈敏的檢測(cè)方法。SoftMax Pro軟件的分析能力通過(guò)一種方便閱讀，客戶可定制的報(bào)告格式提供定量分析。軟件中預(yù)設(shè)的程序使快速的實(shí)驗(yàn)設(shè)置成為可能。

Molecular Devices公司額外的解決方案

SoftMaxProGxP軟件為必須展示符合FDA21CFRPart11的GLP/GMP客戶提供額外的工具和特性。具有優(yōu)化的硬件和軟件驗(yàn)證工具來(lái)加速和簡(jiǎn)便化驗(yàn)證過(guò)程，使展示數(shù)據(jù)采集和分析的符合性更簡(jiǎn)單。

對(duì)于更高的通量要求，Molecular Devices的’StakMax®多孔板操作系統(tǒng)能整合SpectraMax讀板機(jī)并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化處理20,40,或50個(gè)一批的微孔板。

對(duì)于需要檢測(cè)極低水平的DNA的客戶MolecularDevices提供Threshold®系統(tǒng)和Threshold總DNA實(shí)驗(yàn)試劑盒。Threshold系統(tǒng)能檢測(cè)和定量皮克級(jí)污染物，污染物包括總DNA宿主細(xì)胞蛋白，牛源污染物(如BSA，IgG，胰島素，鐵傳遞蛋白)，蛋白A和G，和任何能被抗體結(jié)合的獨(dú)特的蛋白。

更多信息，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)www.moleculardevices.com/home.html

參考

1.Molecular Probes Data Sheet MP 07581 (20 December 2005): Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits.