使用SpectraMax M5e讀板機(jī)進(jìn)行HTRF cAMP dynamic 2和IP-One檢測(cè)

材料

- cAMP dynamic 2 試劑盒，1000個(gè)測(cè)試(Cisbio cat. #62AM4PEB)
- IP-One 試劑盒, 1000個(gè)測(cè)試(Cisbio cat. #62IP1PEB)
- 細(xì)胞系：CHO-M1 (M1WT3;ATCC cat. #CRL-1985)
- 福斯高林(Sigma cat. #F3917)
- 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX;Sigma cat. #I7018)
- 氯化氨甲酰膽堿(碳酰膽堿;Sigma cat. #C4382)
- 白色384-孔微孔板(Corning cat. #3705)
- SpectraMax M5e多功能微孔板讀板機(jī)(Molecular Devices)
注意：通常在SpectraMax M5e上檢測(cè)HTRF使用的是白色微孔板。為優(yōu)化信號(hào)檢測(cè)，使用不透明白色微孔板而非底透板。

方法

cAMP dynamic 2測(cè)定

CHO-M1細(xì)胞生長于添加了10% FBS、1%青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺和200 μg/mLG418的Ham F12培養(yǎng)基中。使用懸浮細(xì)胞進(jìn)行cAMP dynamic 2測(cè)定。細(xì)胞于測(cè)定當(dāng)天進(jìn)行胰酶消化，重懸于無添加的Ham F12培養(yǎng)基中，并以每孔4,000細(xì)胞、10 μL體積接種于白色384-孔微孔板中。為了刺激cAMP產(chǎn)生，添加檢測(cè)試劑前用10 μL終濃度為3 nM到1 mM福斯高林處理處理細(xì)胞一小時(shí)。測(cè)試孔中加入0.5 mMIBMX以抑制磷酸二酯酶介導(dǎo)的cAMP降解。

福斯高林處理一小時(shí)后，按照產(chǎn)品說明書中所述加入cAMP-d2、裂解緩沖液和抗-cAMP抗體-穴狀化合物。細(xì)胞陰性質(zhì)控包含接受了抗-cAMP抗體-穴狀化合物、偶聯(lián)物及不含cAMP-d2的裂解緩沖液的未處理細(xì)胞。FRET陰性質(zhì)控對(duì)Delta F值的計(jì)算是必要的，其在HTRF產(chǎn)品說明書中有所強(qiáng)調(diào)3。所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的最終測(cè)定體積為40 μL，但是測(cè)定體積可以針對(duì)不同微孔板類型調(diào)整。

標(biāo)準(zhǔn)品按照cAMP dynamic 2 HTRF產(chǎn)品說明書所述準(zhǔn)備。cAMP終濃度從0.17到 712nM，并且包括不含cAMP(最大FRET)的陽性質(zhì)控。包含自由cAMP的質(zhì)控用于檢測(cè)測(cè)定的活性，不含cAMP或cAMP-d2的陰性質(zhì)控(無FRET)用于計(jì)算DeltaF。cAMP-d2添加于所有標(biāo)準(zhǔn)品和陽性質(zhì)控中，而接受有偶聯(lián)物的陰性質(zhì)控和裂解緩沖液沒有cAMP-d2�？�-cAMP抗體-穴狀化合物添加于所有標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控中。室溫下孵育一小時(shí)后，在SpectraMax M5e讀板機(jī)上進(jìn)行微孔板讀數(shù)。(請(qǐng)見表1 儀器設(shè)置)。

IP-One測(cè)定

CHO-M1細(xì)胞按上述方法培養(yǎng)。在測(cè)定前一天，細(xì)胞以每孔10,000?40,000接種于含有完全生長培養(yǎng)基的384-孔微孔板中。第二天，使用濃度范圍從15 nM到33 μM的碳酰膽堿刺激細(xì)胞(刺激緩沖液包含用于準(zhǔn)備碳酰膽堿濃度的氯化鋰溶液)。刺激一小時(shí)后，IP1-d2偶聯(lián)物、裂解緩沖液和抗-IP1抗體-穴狀化合物添加于孔中。細(xì)胞陰性質(zhì)控包含接受了抗-IP1抗體-穴狀化合物、偶聯(lián)物和不含IP1-d2的裂解緩沖液的未處理細(xì)胞。最終測(cè)定體積為40 μL，但是此cAMP測(cè)定可針對(duì)不同的微孔板類型調(diào)整體積。

根據(jù)IP-One HTRF產(chǎn)品說明書所述在刺激緩沖液中溶解IP1標(biāo)準(zhǔn)品，使IP1標(biāo)準(zhǔn)品終濃度范圍從21.5到22,000 nM 4。孵育陽性IP1和不含IP1的陰性質(zhì)控。IP1-d2添加于所有標(biāo)準(zhǔn)品和陽性IP1質(zhì)控中，而接受了偶聯(lián)物的陰性質(zhì)控和裂解緩沖液不含IP1-d2�？�-IP1抗體抗體-穴狀化合物添加于所有樣品中。室溫孵育一小時(shí)后，根據(jù)表1中的設(shè)置在SpectraMax M5e讀板機(jī)上進(jìn)行微孔板讀數(shù)。

數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Cisbio的指南使用SoftMax? Pro軟件對(duì)cAMP和IP-One進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。SoftMax Pro軟件中的4個(gè)不同的HTRF預(yù)設(shè)實(shí)驗(yàn)?zāi)０鍖�為各種現(xiàn)階段可用類型的HTRF測(cè)定設(shè)計(jì)以簡化數(shù)據(jù)采集和分析。

儀器設(shè)置

波長、延遲和整合設(shè)置都已針對(duì)基于雙單色器的SpectraMax M5e讀板機(jī)進(jìn)行了優(yōu)化。尤其注意，XL665/d2的最佳發(fā)射波長為668nm而非HTRF產(chǎn)品信息中所說的665nm。

結(jié)果

最佳結(jié)果來自基于細(xì)胞的cAMP測(cè)定，其使用384-孔微孔板并以每孔大約4,000CHO-M1細(xì)胞接種(40 μL檢測(cè)終體積)。最優(yōu)細(xì)胞密度根據(jù)細(xì)胞類型和特定測(cè)定條件可能改變。用福斯高林處理細(xì)胞一小時(shí)后，獲得關(guān)于EC50為11.4 μM和Z’ 因子為0.86的劑量應(yīng)答曲線(圖1)。使用Cisbio比值方程計(jì)算的Delta F%值范圍從47到707(表2)，與觀察到的cAMP標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2，表3)相似。

在基于細(xì)胞的IP-One測(cè)定中，優(yōu)化的細(xì)胞密度為384-孔微孔板每孔10,000個(gè)CHO-M1細(xì)胞(40 μL最終測(cè)定體積)。碳酰膽堿刺激一小時(shí)得到的EC50為0.64 μM和Z’ 因子為0.91的劑量應(yīng)答曲線(圖3)。使用Cisbio比值方程計(jì)算的Delta F%值范圍從3402到12539(表4)。

根據(jù)IP-One HTRF產(chǎn)品說明書直接準(zhǔn)備的IP1標(biāo)準(zhǔn)品生成的校準(zhǔn)曲線其Z’ 因子為0.84(圖4)且Delta F%值范圍從820到11883(表5)。

總結(jié)

具有HTRF認(rèn)證的SpectraMax M5e多功能微孔板讀板機(jī)多功能微孔板讀板機(jī)提升了雙單色器系統(tǒng)和多模式檢測(cè)功能靈活性，擴(kuò)展了研究者們的檢測(cè)方法范圍。當(dāng)在SpectraMax M5e讀板機(jī)上運(yùn)行IP-One和cAMP HTRF測(cè)定時(shí)，展示了非常寬的動(dòng)態(tài)范圍和范圍從0.78到0.91的完美Z’ 因子。使用SoftMax Pro軟件的預(yù)設(shè)HTRF實(shí)驗(yàn)?zāi)０宕蟠蠛喕�了�?shù)據(jù)分析。

參考

1. TR-FRET Basics (www.htrf.com)
2. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., and Oldenburg,K. R. (1999). A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol Scrn 4(2): 67-73.
3. cAMP dynamic 2 HTRF kit package insert(Cisbio international, France).
4. IP-One HTRF kit package insert (Cisbio international, France).