應(yīng)用FLIPR系統(tǒng)檢測(cè)iCell心肌細(xì)胞鈣振蕩

簡介

藥物有效性和安全性篩選成本的持續(xù)增加導(dǎo)致了對(duì)創(chuàng)新技術(shù)的需求，從而在藥物發(fā)現(xiàn)過程中更早地進(jìn)行表征和特性的檢測(cè)分析。FDA正在制定化合物檢測(cè)的指導(dǎo)方針，以確保藥物的安全性，使得藥物無需因?yàn)椴涣挤磻?yīng)而撤市， 例如阻斷心臟hERG通道，并導(dǎo)致像尖端扭轉(zhuǎn)型室性心律失常這樣的癥狀。這一方向被稱為全面的體外心律失常試驗(yàn)或CiPA項(xiàng)目。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)分化的心肌細(xì)胞因其用于評(píng)估對(duì)心臟功能和安全性的復(fù)合作用，在體外模型系統(tǒng)被廣泛使用。鈣信號(hào)振蕩的結(jié)果可以反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化， 從而可以使用鈣敏感染料如EarlyTox™熒光染料試劑盒進(jìn)行信號(hào)的檢測(cè)。ScreenWorks®Pro軟件可以分析心肌細(xì)胞跳動(dòng)峰值的頻率，峰值10%的振幅峰寬，以及其他參數(shù)以高通量篩選的方式來描述化合物影響心肌細(xì)胞。

干細(xì)胞公司CDI (Cellular DynamicsInternational) 已經(jīng)開發(fā)了一種增強(qiáng)版的iPSCs分化的心肌細(xì)胞，其復(fù)蘇后恢復(fù)的速度比之前版本的iPSCs更快。這樣的改進(jìn)使得在FLIPR Tetra 高通量實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)上檢測(cè)化合物對(duì)跳動(dòng)的心肌細(xì)胞鈣瞬變信號(hào)影響的工作流程縮短生長時(shí)間5 - 7天。圖1是示例的工作流程。本文中我們闡述了一些癌癥化合物的檢測(cè)，其中一些已知會(huì)影響hERG通道，其它化合物已知可以阻斷hERG通道。

優(yōu)勢(shì)

• 縮短細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)的工作流程和質(zhì)量
• 在藥物發(fā)現(xiàn)過程中更早地發(fā)現(xiàn)可能導(dǎo)致安全問題的化合物
• ScreenWorks Peak Pro軟件簡化數(shù)據(jù)分析

材料

• iCell® Cardiomyocytes2 試劑盒，包括細(xì)胞、鋪板培養(yǎng)基和維持培養(yǎng)基 (Provided byCellular Dynamics, International)
• 0.1% (w/v) 明膠
• 384孔黑壁底透多孔板 (Corning PN 3712)
• EarlyTox 心肌細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(Molecular Devices PN R8210)
• 測(cè)試化合物和DMSO (Sigma Aldrich)
• FLIPR Tetra 高通量實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)(Molecular Devices)

準(zhǔn)備iCell心肌細(xì)胞多孔板

在iCell心肌細(xì)胞使用指南的指導(dǎo)下，用0.1%的明膠包被384孔黑壁底透多孔板。iCell心肌細(xì)胞復(fù)蘇后以8000個(gè)細(xì)胞每孔的密度鋪在每孔25μL的培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37°C、5% CO2、以及100%濕度條件下培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞形成單層并更換成維持培養(yǎng)基。細(xì)胞每隔一天更換一次維持培養(yǎng)基。在第5天，細(xì)胞開始同步跳動(dòng)并可以用于實(shí)驗(yàn)。

準(zhǔn)備化合物板用于篩選檢測(cè)

為便于篩選檢測(cè)，化合物溶于100% DMSO配置成10 MM的母液。維持培養(yǎng)基稀釋母液至10-100 μM的檢測(cè)濃度。在使用FLIPRTetra系統(tǒng)檢測(cè)前，提前24小時(shí)將稀釋好的化合物溶液添加到每個(gè)孔中。DMSO在培養(yǎng)基中的最終濃度為0.15%(v / v)。濃度范圍從30或100μM對(duì)數(shù)稀釋的每個(gè)濃度的化合物進(jìn)行兩次(n = 2)或三次(n = 3)的檢測(cè)。

使用FLIPR Tetra系統(tǒng)觀察鈣振蕩

實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)，以終濃度30μM開始的對(duì)數(shù)稀釋的各種化合物加入到iPSC 心肌細(xì)胞中。檢測(cè)之前兩個(gè)小時(shí)25μL體積的溶于維持培養(yǎng)基的2倍濃度的EarlyTox心肌細(xì)胞毒性檢測(cè)染料添加到每孔中，并在37°C、5% CO2條件下孵育。當(dāng)細(xì)胞從培養(yǎng)箱取出后，鈣離子濃度的變化會(huì)隨著細(xì)胞的振蕩而變化，從而引起FLIPR Tetra系統(tǒng)所記錄的熒光信號(hào)的改變。在ScreenWorks工作軟件中的實(shí)驗(yàn)方案和參數(shù)設(shè)置如表1所示。數(shù)據(jù)分析使用了ScreenWorks PeakPro軟件模塊，并在GraphPad Prism 6中繪制了圖形。

化合物對(duì)心肌細(xì)胞跳動(dòng)的峰值參數(shù)的影響

用FLIPR Tetra系統(tǒng)在化合物添加24小時(shí)后進(jìn)行鈣振蕩信號(hào)的檢測(cè)和記錄。iPSC2s與之前版本的iPSCs以相同的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過形成縫隙連接并同步振蕩，檢測(cè)到鈣敏感染料指示的峰值頻率。新型細(xì)胞比之前版本的細(xì)胞可提早4-5天用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)因其更低的污染風(fēng)險(xiǎn)和一個(gè)整體較短的時(shí)間周期并得到類似的結(jié)果，明顯改善了篩選的工作流程。用于實(shí)驗(yàn)研究的抗腫瘤化合物包括：舒尼替尼、伊馬替尼和星形孢菌素(由于毒性原因而不作臨床使用的化合物)均是激酶抑制劑；白消安，一個(gè)烷基磺酸鹽；阿霉素，一種蒽環(huán)類藥物；依托泊苷，一種拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑；而紫杉醇會(huì)干擾細(xì)胞管蛋白的生成。在化合物添加24小時(shí)后，一些鈣振蕩信號(hào)變化明顯異于對(duì)照組(圖2)。舒尼替尼的振蕩頻率較低，且在10%峰值高度的峰寬顯著大于對(duì)照組。其它具有相似鈣振蕩結(jié)果的抗癌化合物包括伊馬替尼(Imatinib)和星形孢菌素(Staurosporine)。這三種化合物與阻斷hERG通道有關(guān)。hERG基因編碼了鉀通道，有助于心臟跳動(dòng)的恢復(fù)，其被阻斷有可能引起長QT綜合征或尖端扭轉(zhuǎn)型室性心律失常。紫杉醇、白消安和依托泊苷未知有hERG活性，且沒有類似的鈣振蕩減慢效應(yīng)，也沒有10%峰值高度的峰寬增大的效應(yīng)。量效曲線顯示，24小時(shí)暴露于阿霉素和舒尼替尼后峰值頻率顯著降低。紫杉醇也是一種不影響峰值頻率的化合物(圖3)。除抗癌化合物外，已知的hERG阻斷劑氟哌利多，一種抗精神病藥物和多巴胺受體阻斷劑；阿米替林，三環(huán)抗抑郁藥和5-羥色胺受體抑制劑；以及西沙必利，一種抗酸劑，均是已知的可導(dǎo)致長QT綜合征。此三種化合物也都在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了檢測(cè)。在24小時(shí)內(nèi)加入iPSC2s時(shí)，這三種化合物的峰值頻率都在降低以及10%峰值高度的峰寬增大(圖4)。在鈣振蕩測(cè)定中所測(cè)試的所有化合物的IC50值的總結(jié)如表2所示。

結(jié)論

iPSC2心肌細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞解凍后的4 - 5天內(nèi)，而不是10 - 14天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而改善了在FLIPR Tetra系統(tǒng)上進(jìn)行篩選檢測(cè)的工作流程。ScreenWorks Peak Pro軟件模塊可以通過對(duì)鈣振蕩信號(hào)的記錄和分析，非常便捷地證實(shí)化合物對(duì)心肌細(xì)胞的效應(yīng)，是藥物篩選過程中的有效工具。這樣的試驗(yàn)可以在藥物開發(fā)早期進(jìn)行，有助于在進(jìn)入先導(dǎo)化合物開發(fā)流程之前發(fā)現(xiàn)可能對(duì)心臟產(chǎn)生不利或有益影響的化合物。

參考文獻(xiàn)：

1. Sirenko, Oksana, et al. “Phenotypic Assaysfor Characterizing Compound Effects onInduced Pluripotent Stem Cell-DerivedCardiac Spheroids.” ASSAY and DrugDevelopment Technologies, vol. 15, no. 6,2017, pp. 280‒296., doi:10.1089/adt.2017.792.
2. Sirenko, Oksana, et al. “Invitrocardiotoxicityassessmentofenvironmentalchemicalsusinganorganotypic human induced pluripotentstem cell-Derived model.” Toxicology andAppliedPharmacology, vol. 322, 2017, pp.60‒74., doi:10.1016/j.taap.2017.02.020.
3. Sirenko, Oksana, et al. “Assessment ofbeating parameters in human inducedpluripotent stem cells enables quantitative invitro screening for cardiotoxicity.”Toxicology and Applied Pharmacology, vol.273, no. 3, 2013, pp. 500‒507.,doi:10.1016/j.taap.2013.09.017.
4. “iCell Cardiomyocytes2 User Guide.”Cellular Dynamics International, Aug 2016.