乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明

乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

一基的乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)，也稱(chēng)乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒(LDH Assay Kit)或乳酸脫氫酶釋放檢測(cè)試劑盒(LDH Release Assay Kit)，是一種基于diaphorase催化的INT顯色反應(yīng)，通過(guò)比色法檢測(cè)細(xì)胞毒性時(shí)釋放的乳酸脫氫酶活性或檢測(cè)其它樣品中的乳酸脫氫酶活性的試劑盒。

• 本試劑盒可以用于常規(guī)的乳酸脫氫酶活性的檢測(cè)，更常用于以L(fǎng)DH釋放為指標(biāo)的細(xì)胞毒性檢測(cè)。同時(shí)，基于細(xì)胞總?cè)樗崦摎涿富钚缘臋z測(cè)，本試劑盒也可以用于檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)。
• 細(xì)胞凋亡或壞死而造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液里，其中包括酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶

(lactate dehydrogenase, LDH)。通過(guò)檢測(cè)從質(zhì)膜破裂的細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH的活性，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞毒性的定量分析。LDH釋放被看做細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，并被廣泛用于細(xì)胞毒性檢測(cè)。LDH釋放被認(rèn)為是以前使用放射性的51Cr標(biāo)記細(xì)胞，隨后通過(guò)51Cr釋放進(jìn)行細(xì)胞膜完整性檢測(cè)的安全有效的替代方法。

本試劑盒的基本原理是，在乳酸脫氫酶的作用下，NAD⁺被還原生成NADH，NADH和INT (2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)催化反應(yīng)生成NAD⁺和強(qiáng)生色物甲臜(formazan)，在490nm波長(zhǎng)下產(chǎn)生吸收峰，從而可以通過(guò)比色來(lái)定量乳酸脫氫酶的活性。吸光度與乳酸脫氫酶活性成線(xiàn)性正相關(guān)。該酶聯(lián)反應(yīng)原理的示意圖如下：

Ø 可檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞裂解液等樣品中乳酸脫氫酶的活性。一個(gè)試劑盒可進(jìn)行500次檢測(cè)。

包裝清單：

保存條件：

-20ºC保存，一年有效。C0017-3需注意避免反復(fù)凍融。C0017-4需避光保存。試劑盒解凍后可以短期4ºC存放，2-3天內(nèi)有效。

注意事項(xiàng)：

冷凍會(huì)使樣品中部分乳酸脫氫酶失活，4ºC可放置2-3天。建議樣品準(zhǔn)備好后盡量當(dāng)天完成測(cè)定。

如果檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶，由于血清含有乳酸脫氫酶，建議血清的使用濃度不要超過(guò)1%，并最好使用熱滅活血清。如果一定需要使用10%血清，在檢測(cè)時(shí)一定要設(shè)置沒(méi)有細(xì)胞，但加入了相同體積培養(yǎng)液的對(duì)照孔，以用于消除背景。

• 細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)、密度過(guò)高、離心速度過(guò)大、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過(guò)大，都會(huì)造成細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶增加。

如果希望進(jìn)行乳酸脫氫酶活性的絕對(duì)定量，用戶(hù)需自備乳酸脫氫酶標(biāo)準(zhǔn)品。

• 本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明：

樣品的準(zhǔn)備：

方法一：LDH釋放檢測(cè)

a.  根據(jù)細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使待檢測(cè)時(shí)細(xì)胞密度不超過(guò)80-90%滿(mǎn)。

到達(dá)預(yù)定時(shí)間后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔

中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。

方法二：細(xì)胞內(nèi)總LDH的檢測(cè)

細(xì)胞毒性檢測(cè)：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使待檢測(cè)時(shí)細(xì)胞密度不超過(guò)80-90%滿(mǎn)。加入不同藥物進(jìn)行處理，并設(shè)置適當(dāng)對(duì)照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻)，適當(dāng)搖晃培養(yǎng)板混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。

細(xì)胞增殖檢測(cè)：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使促進(jìn)細(xì)胞增殖的藥物刺激后細(xì)胞不超過(guò)80-90%滿(mǎn)為宜。使用不同的藥物刺激細(xì)胞，并設(shè)置適當(dāng)對(duì)照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻)，適當(dāng)搖晃混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。

注：LDH釋放檢測(cè)更加常用一些，細(xì)胞內(nèi)總LDH檢測(cè)通�？梢允褂肕TT、WST-1或CCK-8等方法替代。

附錄1：

可同時(shí)測(cè)定一已知濃度的LDH酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的吸光度值，參考以下公式粗略計(jì)算出樣品中LDH酶活力：待測(cè)樣品中LDH活力單位(mU/ml)＝(樣品孔吸光度－背景空白對(duì)照孔吸光度) / (標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mU/ml )；根據(jù)計(jì)算結(jié)果可以比較不同樣品處理組間有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異等。

附錄2：

若需準(zhǔn)確計(jì)算出LDH酶活性的絕對(duì)活性，可通過(guò)一系列LDH標(biāo)準(zhǔn)品及相應(yīng)測(cè)得的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相應(yīng)公式計(jì)算出樣品中LDH的酶活性。

各孔數(shù)值減去空白對(duì)照后，以檢測(cè)的吸光度(OD490)為縱坐標(biāo)，LDH酶活力(mU)為橫坐標(biāo)，繪制LDH標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。同時(shí)計(jì)算出該趨勢(shì)線(xiàn)的公式。