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2018國自然研究熱點二： RNA甲基化研究深度剖析

瀏覽次數(shù)：3773　發(fā)布日期：2018-3-2　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

一、聽說最近 RNA甲基化很火，它是何方神圣？

1、高分文章頻現(xiàn)

說起近來的科研熱點，RNA甲基化修飾的相關研究可以說是當前整個生命科學領域最熱門的方向之一，亮點文章頻出，著實讓人有些目不暇接。RNA甲基化的研究近3月發(fā)表的文章影響因子為10分以上的，就有高達 17 篇。

圖：RNA甲基化近期高分文章一窺

2、文章數(shù)屢攀新高

日益增多的發(fā)表文章、特別是高分文章說明，這個領域現(xiàn)在正在迅速成為大家關注的焦點。而就歷年發(fā)表情況來看，RNA甲基化領域的增長勢頭也十分喜人，僅2018年1月已發(fā)表文獻就達到了25篇。

圖：RNA甲基化歷年發(fā)文章數(shù)據(jù)

3、國自然立項數(shù)漲勢喜人

縱向?qū)Ρ葰v年立項數(shù)，我們可以發(fā)現(xiàn)，RNA甲基化這兩年的基金項目呈指數(shù)級增長的趨勢：特別是從2015年的5項到2017年的25項，項目增長尤為顯著。

圖： RNA甲基化歷年國自然立項情況

由上圖可知，2017年國家自然科學金獲批的項目中，RNA甲基化研究相關的項目總數(shù)為25項。從獲批的項目的研究內(nèi)容來看，既有單純鑒定RNA甲基化譜的課題，也有從RNA甲基化修飾酶入手的課題，以及針對RNA甲基化的功能機制展開的課題。這表明RNA甲基化的研究還是處于一個基礎篩選與功能機制齊飛，比較多樣化的狀態(tài)。值得一提的是，也有課題將RNA甲基化修飾與miRNA以及外泌體分泌聯(lián)系起來，以篩選/鑒定腫瘤分子標志物，這也是一個值得嘗試的RNA甲基化重要方向。

咱們舉例來看一下2017年的具體立項情況，我們也可以看出，除了鑒定RNA甲基化相關酶的切入點，RNA甲基化課題涵蓋范圍極其廣泛，包括了：疾病發(fā)生發(fā)展、水稻生殖發(fā)育、果蠅性別決定等諸多重要領域。

圖： RNA甲基化修飾2017國自然立項列舉

二、聽說有3種RNA甲基化修飾大熱，他們是誰？

RNA甲基化修飾類型很多，目前最熱門的有三種，分別是：m6A RNA甲基化﹑m5C RNA甲基化﹑m1A RNA甲基化。

圖： 3種熱門RNA甲基化修飾

1、m6A RNA甲基化是最常見、最豐富的真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾，現(xiàn)在的研究主要是圍繞各修飾的關鍵酶展開。何川教授在2017年1月的Nature Review（IF=46.602）上總結(jié)過m6A的相關修飾，由甲基轉(zhuǎn)移酶復合體（METTL3、METTL14和WTAP組成）、去甲基酶（FTO和ALKBH5）以及相應的閱讀器（YTHDF1/2/3，YTHDC1）協(xié)同調(diào)控。相關功能的研究證明了m6A修飾是動態(tài)可逆的，而且具有種類多樣而又廣泛的重要生物學意義。已發(fā)現(xiàn)的m6A RNA甲基化功能有很多，比如它可以促進環(huán)狀RNA翻譯(2017.3 Cell Res, IF 14.812)，或者通過促進mRNA降解來調(diào)控癌癥干細胞的分化(2016.4 Cell Host Microbe, IF9.661)，還能調(diào)控T細胞分化及免疫穩(wěn)態(tài)(2017.8 Nature. IF 40.137)。

圖： m6A RNA甲基化動態(tài)可逆修飾

2、m5C RNA甲基化是近年來發(fā)現(xiàn)一類在tRNA及rRNA高豐度存在的甲基化修飾。利用高通量測序手段驗證了非編碼RNA以及部分mRNA中m5C廣泛存在，但是在不同物種、不同組織中m5C修飾分布圖譜尚沒有系統(tǒng)性報道。對于m5C來說，也有一系列的相關修飾酶(如下圖)。m5C RNA甲基化功能，目前發(fā)現(xiàn)他可以調(diào)控mRNA出核(2017 Cell Res, IF 14.812)，或者調(diào)控干細胞蛋白質(zhì)合成(2017 Nature, IF 40.137)。

圖： m5C RNA甲基化動態(tài)可逆修飾

3、m1A RNA甲基化是一個新進入大家的視野的RNA甲基化修飾類型。最近發(fā)表在Molecular Cell （IF：14.714）上的一篇關于m1A RNA甲基化的文章介紹到這是一類新型RNA修飾，它普遍存在于非編碼RNA和mRNA中。m1A RNA甲基化功能，目前發(fā)現(xiàn)tRNA上發(fā)生多種m1A修飾(2017.2 Nucleic Acids Research， IF 9.28)，或者參與調(diào)控翻譯起始和延伸(2016 Cell，IF 30.41)。總之，RNA甲基化也是調(diào)控基因表達的一種重要途徑。

圖：m1A RNA甲基化動態(tài)可逆修飾

三、RNA甲基化相關的酶有哪些？

RNA甲基化修飾相關蛋白包含特定甲基化修飾特有的甲基轉(zhuǎn)移酶（Writer）、去甲基酶（Reader）以及相應的RNA甲基化識別蛋白（Reader）協(xié)同調(diào)控，以維持特定類型甲基化的動態(tài)修飾。許多高分文章都是針對甲基化修飾蛋白來進行功能機制研究。那么至今為止，不同的甲基化修飾的關鍵修飾蛋白都有哪些呢？經(jīng)過翻閱文獻查找，小編幫大家總結(jié)了一下目前文獻報導的相關修飾蛋白，方便大家參考：

圖： RNA甲基化修飾相關酶整理

四、RNA甲基化這么火，它的研究思路是怎樣的呢？

RNA甲基化目前的研究思路由淺及深，也是有兩大類：1、RNA甲基化譜2、功能機制研究。那么且讓咱們分門別類、細細道來！

1、RNA甲基化譜

由于RNA甲基化領域非常新，絕大部分物種、組織和疾病中的RNA甲基化分布圖譜尚未報道。對于想要短平快的發(fā)表文章的老師來說，RNA甲基化譜分析是非常合適的。

一篇RNA甲基化譜的文章是怎么煉成的？研究伊始，我們要確定好研究目標：物種，疾病模型，樣品類型、盡可能詳盡的樣品信息。接下來，通過RNA甲基化測序高通量地篩選RNA甲基化區(qū)域或位點，并進行深入的生物信息挖掘，例如：甲基化位點統(tǒng)計﹑基因組分布﹑甲基化基因功能進行預測（GO、Pathway分析）等等。

圖： RNA甲基化表達譜思路圖

咱們就以一篇影響因子11分的典型的RNA甲基化譜文章為例，來了解一下吧。這篇文章發(fā)表在Genome Biology上，展示了小鼠胚胎干細胞及大腦中的m5C RNA修飾整體狀況。

圖： m5C RNA甲基化位點統(tǒng)計

首先通過 Bis-seq技術對不同樣本中總poly（A）RNA和核poly（A）RNA的 m5C位點共分析和特異性分析。

圖： qPCR驗證m5C RNA甲基化測序結(jié)果

隨后用qPCR驗證m5C修飾位點，從圖上可以看到16個驗證的轉(zhuǎn)錄本中13個都顯著富集。接著對m5C RNA甲基化測序的結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ESC總poly（A）RNA中特異的m5C甲基化修飾是由于甲基化程度的差異造成的，而與由不同樣本間基因差異表達無關。并對m5C修飾的RNA對應基因進行功能預測，顯示小鼠腦組織及小鼠胚胎干細胞間共有和特有的前十條GO條目。

圖：不同樣本的m5C位點分布規(guī)律

進一步的數(shù)據(jù)分析顯示，不同樣本的總poly（A）RNA中m5C位點一致的分布規(guī)律：小鼠胚胎干細胞中m5C修飾位點優(yōu)先分布于mRNA起始密碼子附近，在小鼠腦組織中則傾向于分布在3’UTR區(qū)。

圖： CLIPdb : m5C位點與RBPs結(jié)合位點的共分析

通過與CLIPdb的數(shù)據(jù)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，小鼠胚胎干細胞中大約29%的poly（A）m5C RNA修飾位點與對應RBP（RNA結(jié)合蛋白）結(jié)合位點重合，這一百分數(shù)在小鼠腦組織中大約為11%，顯示出與RBP結(jié)合并在特定轉(zhuǎn)錄本中發(fā)揮生物學功能的潛力。

到這里這樣一篇m5C RNA修飾表達譜的文章就結(jié)束了，可以看出幾乎沒有涉及到實驗操作，僅僅是針對m5C RNA甲基化測序的結(jié)果進行詳盡的展示和分析。亮點是還聯(lián)合CLIPdp的數(shù)據(jù)預測了一下m5C RNA甲基化位點作為RBP靶點的潛力。值得我們借鑒。

2、功能機制研究

看完了表達譜，那么RNA甲基化的功能機制要如何研究？咱們就以一篇影響因子27分的Cancer Cell文章為例，來了解一下吧。這是一篇來自于美國安德森癌癥中心黃素云課題組與芝加哥大學何川課題組合作的課題，揭示了m6A RNA甲基化在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用。

首先放一下技術路線圖。

圖：展示的文章功能集中技術路線圖

TCGA數(shù)據(jù)庫顯示GSC中m6A去甲基化酶ALKBH5的表達水平明顯升高。對不同病人的預后檢測，生存曲線發(fā)現(xiàn)ALKBH5高表達的病人預后更差。

圖：ALKBH5與較差的臨床預后相關

作者通過MeRIP-Seq技術鑒定m6A RNA甲基化修飾圖譜，聯(lián)合表達譜檢測差異表達>2倍的基因。最終篩選到與細胞周期調(diào)控相關的ALKBH5靶基因－FOXM1，其在GSCs的自我修復和腫瘤形成中起到關鍵作用。

圖： ALKBH5作用靶基因——FOXM1篩選流程圖

通過MeRIP qPCR發(fā)現(xiàn)敲低ALKBH5可增加FOXM1前體mRNA的m6A甲基化水平。這些結(jié)果表明ALKBH5主要通過去甲基化活性影響FOXM1的表達。

圖：敲低ALKBH5上調(diào)FOXM1的前體mRNA表達及m6A RNA修飾

通過RIP、RNA pull down實驗表明FOXM1-AS可與ALKBH5和FOXM1前體mRNA直接結(jié)合。

圖：RIP和RNA Pull down實驗證明ALKBH5和FOXM1-AS 直接結(jié)合

最后，作者進一步研究了FOXM1-AS對惡性膠質(zhì)瘤細胞生物學功能的影響，結(jié)果表明FOXM1-AS可正調(diào)控FOXM1的表達，并可維持惡性膠質(zhì)瘤細胞性能。而外源性的FOXM1可顯著逆轉(zhuǎn)敲低ALKBH5引起的抑制作用。

五、RNA甲基化研究常用技術

1、云序生物MeRIP-Seq

適用范圍：m6A RNA甲基化﹑m5C RNA甲基化﹑m1A RNA甲基化；

技術原理：用特異性抗體富集甲基化RNA后再對其進行高通量測序檢測；

目前對RNA甲基化最流行的檢測手段為MeRIP-Seq技術，該技術將甲基化RNA免疫共沉淀和RNA測序技術組合起來，高精度地檢測全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的RNA甲基化修飾。具體原理如下：將針對特定RNA甲基化修飾的抗體與RNA樣品共孵育（IP），抓取有甲基化修飾的RNA片段進行測序；同時需要平行測序一個對照（Input）樣本，用于消除非特異性抓取甲基化片段的背景。對比免疫共沉淀樣本(IP)和對照樣本（Input）中的序列片段，將RNA甲基化修飾位區(qū)域定位到轉(zhuǎn)錄組上，并計算樣本中RNA甲基化程度。云序生物具有全面的m6A﹑m5C﹑m1A甲基化MeRIP-Seq產(chǎn)品線，能夠?qū)ircRNA，LncRNA，mRNA中的各類RNA甲基化修飾進行全面的檢測。

圖：云序生物MeRIP-seq實驗流程

2、云序生物Bis-Seq
適用范圍：m5C RNA甲基化；

技術原理：對重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的RNA進行高通量測序檢測；

針對m5C RNA甲基化的修飾還有一種單堿基分辨的檢測手段：用重亞硫酸鹽（Bisulfite）處理樣品。重亞硫酸鹽處理能夠?qū)⒒蚪M中未發(fā)生甲基化的C堿基轉(zhuǎn)換成U，進行PCR擴增后變成T，這樣反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物就會出現(xiàn)單點突變，結(jié)合高通量測序技術，通過與不處理組進行序列比對，就可以很容易的找出m5C修飾的位點。云序生物具有成熟的Bis-seq實驗平臺以及豐富的RNA甲基化測序經(jīng)驗，可以滿足客戶對不同樣本、不同類型RNA甲基化測序的各類需求。

圖：云序生物m5C Bis-Seq 實驗流程

3、云序生物RIP 和 RNA Pull down

當測序、篩選和驗證工作結(jié)束后，想要發(fā)表高分文章，那么功能機制實驗的進行往往還少不了兩個好幫手：RIP和RNA pull down實驗，主要用來證實候選靶基因與甲基化相關蛋白的直接結(jié)合，是解析RNA甲基化調(diào)控機制的利器。就像上面舉例的CancerCell一文里，作者通過RIP、RNA pull down實驗來證明受RNA甲基化調(diào)控的靶基因可與去甲基化酶ALKBH5直接結(jié)合。

那么RIP和RNA pull down是什么呢？

①RIP（RNA Immunoprecipitation）是RNA免疫共沉淀技術.利用抗體特異性結(jié)合目的蛋白,進而檢測與該蛋白結(jié)合的RNA分子，用于檢測特定蛋白質(zhì)與RNA的相互作用。RIP-Seq結(jié)合RIP技術和高通量測序，能夠高通量地檢測與特定蛋白結(jié)合的RNA，從而解析全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的目標蛋白-RNA相互作用網(wǎng)絡。RIP-qPCR則可以檢測特定蛋白上結(jié)合的RNA分子。例如可以通過RIP-qPCR檢測甲基化修飾相關酶是否與某RNA分子結(jié)合。

②RNA Pull down是利用特定探針把目的RNA拉下來，進而檢測與之結(jié)合的RNA或蛋白質(zhì)。用于檢測特定RNA與蛋白質(zhì)/RNA的相互作用。RNA Pull down后接Western Blot可以檢測特定的RNA是否與特定的RNA結(jié)合蛋白相互作用。RNA Pull down后接質(zhì)譜實驗則可以解析蛋白質(zhì)組范圍內(nèi)的所有蛋白信息。

圖：云序生物RIP-seq及RNA Pull down實驗流程

六、RNA甲基化項目國自然申請建議

1、RNA甲基化研究目前處于上升期，可以嘗試設計特定細胞、組織類型表達譜的研究內(nèi)容。盡早進行表達譜分析，找到研究價值高的的差異修飾分子，豐富功能預測信息，并開展一些簡單的驗證實驗。同時，最好能形成大致的功能機制研究的輪廓。也可以嘗試和其他科研熱點相結(jié)合，比如外泌體中m6A修飾的miRNA表達譜。

2、結(jié)合特定RNA甲基化修飾類型的修飾酶，開展功能機制研究。機制研究方向上，靈活運用利用多種有效地分析RNA分子與其他分子或蛋白相互作用的研究工具。包括RIP，RNA pull-down等實驗技術，如果能得到有效數(shù)據(jù)，會在國自然科學基金申請中增色不少。

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