人源化小鼠模型在人類疾病研究中的應用

俞曉峰 博士，高級科學家

俞曉峰博士現(xiàn)任賽業(yè)模式生物副總裁、高級科學家，負責基因修飾模式動物的研發(fā)與技術服務等工作。

俞博士在遺傳基因模式動物領域有超過20年研發(fā)與管理等方面的豐富經(jīng)驗，在干細胞相關領域及哺乳動物細胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次發(fā)表在Nature Immunology、Hum Mol Genet、Mol Cell Biol等高水平雜志上。加入賽業(yè)生物前，俞博士2010-2013年任職于美國應用干細胞（ASC）公司，擔任研發(fā)總監(jiān)，負責基因修飾模式動物的研發(fā)與定制服務，并在中國子公司斯坦福生物科技擔任副總裁一職。2009-2010任紐約大學醫(yī)學院研究員。

2003-2009期間任職于美國基因打靶公司（iTL），作為資深科學家和項目經(jīng)理負責參與了基因修飾小鼠模型研發(fā)方案與策略設計、項目管理、技術人員指導與培訓、以及客戶服務和技術咨詢等方面工作，2007年起負責開發(fā)了p53基因不同點突變的人源化腫瘤小鼠模型庫項目。2000年任美國耶魯大學醫(yī)學院研究員。1995年獲得軍事醫(yī)學科學院博士學位。

專訪篇

目前在人源化小鼠模型的研究過程中，還存在哪些問題，還有哪些改進方法與策略？人源化小鼠在哪些領域應用？為此，本期中國實驗動物信息網(wǎng)特邀賽業(yè)模式生物高級科學家俞曉峰博士為大家詳細講解。

中國實驗動物信息網(wǎng)：為什么要構建人源化小鼠模型？人源化小鼠模型的發(fā)展歷程？

俞博士：將人基因、細胞與組織通過基因修飾或移植到免疫缺陷小鼠的方式來構建的小鼠模型即為人源化小鼠模型。人源化小鼠模型已經(jīng)成為研究人類疾病的重要臨床前動物實驗模型。

由于直接利用人細胞及組織進行相關研究受到邏輯與倫理方面的限制，動物模型就成為人類生物學研究的替代選擇。小鼠因體積小，易維持與操作，繁殖周期短， 與人在基因組和生理學等特征方面相似，以及已經(jīng)有相應成熟的基因修飾技術方法等因素，使其成為廣泛應用的哺乳動物模式生物系統(tǒng)。

盡管小鼠模型研究已經(jīng)取得了大量基礎生物學相關方面成果，然而，對于揭示人類生物學方面，小鼠模型仍然存在局限性。小鼠生物系統(tǒng)中，特別是免疫系統(tǒng)，與人不完全一致，突出表現(xiàn)在先天免疫分子方面存在許多的不同，例如，小鼠缺乏功能性的TLR10，而在小鼠體內(nèi)表達的TLR11、 TLR12 和TLR13，在人體內(nèi)卻是沒有的。

而且，許多人致病因子和藥物具有種系特異性。某些病原體引起的免疫反應特性與致病過程只針對人細胞，往往不是小鼠的感染病原體。由于這些問題及因素的存在，限制了小鼠模型成為真正能全面揭示人類生物學系統(tǒng)等研究的可靠性及有效工具。

因此，建立有效的人源化小鼠模型作為研究人特異性感染病原體，癌癥生物學及其免疫治療的臨床前模型等方面，將發(fā)揮著越來越重要的作用。另外，人源化小鼠作為轉(zhuǎn)化醫(yī)學模型，包括再生醫(yī)學、移植和免疫學等生物學研究的需求也在不斷增加。

早期的人源化小鼠模型的建立多是通過移植人細胞或組織至免疫缺陷小鼠來實現(xiàn)的。最早的人源化小鼠模型建立要追溯到1962年應用無胸腺裸鼠，然后是1983年因Prkdc基因缺失的SCID小鼠及1995年NOD-SCID小鼠的應用。然而，免疫缺陷小鼠應用的真正突變性進展發(fā)生在2000年早期，在原免疫缺陷的小鼠（如NOD-SCID) 的基礎上，通過將IL2受體的伽馬(γ） 共用鏈（IL2rg)敲除，而成功研制出新型免疫缺陷IL2rg小鼠。由于該共用γ鏈是包括許多細胞因子（如IL2，IL4，IL7，IL9，IL15和IL21）受體重要組成部分，所以IL2rg是這些細胞因子高親和力結合與信號傳遞不可缺少的成分。因此，在NOD/SCID 突變，或Rag1/Rag2突變基礎上，同時敲除小鼠IL2rg結構部分而構建的免疫缺陷IL2rg小鼠，具有先天免疫缺失（包括無小鼠NK細胞）和獲得性免疫都明顯缺失的特征。

目前，廣泛應用的免疫缺陷IL2rg小鼠有三種：1. 2002年日本CIEA研制的NOG (NOD Shi. Cg-Prkdc IL2rg)； 2. 2005年JAX研制的NSG（NOD. Cg-Prkdc IL2rg)，3. 2004年日本CIEA的BRG (BALB/c-Rag2 IL2rg)。NOG小鼠含有縮短γ鏈胞漿部分，雖然此部分可以結合細胞因子，但因無信號域部分，所以無信號傳遞功能；而NSG和BRG小鼠則完全缺失γ鏈部分。與以前的人源化小鼠（如NOD-SCID）相比，當人細胞，組織和免疫系統(tǒng)移植至小鼠體內(nèi)后，在此類人源化小鼠體內(nèi)的生物學反應更能真實地反應人體內(nèi)的生物學現(xiàn)象。

中國實驗動物信息網(wǎng)：建立在免疫缺陷小鼠基礎上的人源化小鼠模型有哪幾種主要的構建方法？

俞博士：目前，通過將人細胞及組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，實現(xiàn)人源化小鼠模型建立的方式，由于其操作過程相對簡單，效率高，且成本低，所以用該方法建立人源化小鼠已經(jīng)廣泛應用于人感染性疾病，癌癥，再生醫(yī)學，移植與宿主，過敏和免疫等領域的基礎與臨床前實驗動物模型的研究。目前應用免疫缺陷小鼠構建人免疫系統(tǒng)，通常有三種方法。1. Hu-PBL-SCID模型，借助注射人外周血白細胞實現(xiàn)。該方法可以很快（第一周末）就可以獲得人CD3 + T細胞，是體內(nèi)研究人T細胞功能的極好模型。由于致死異種導致的移植物抗宿主疾�。℅VHD)的形成，該方法的缺點是實驗觀察窗口較短（通常只有4-8周）, 但此實驗窗口期可以通過改造NSG小鼠，使其缺失MHC-I或II得到延長。

2. Hu-SRC-SCID模型， 通過靜脈或股骨內(nèi)注射來自人骨髓，臍帶血，胎肝，或G-CSF激活的外周血等的人CD34 + HSC細胞。該模型支持完整的人免疫系統(tǒng)的移植。 雖然，B細胞，T細胞，髓系細胞和抗原提呈細胞（APCs) 存在于外周造血干細胞，但是，在小鼠血液中觀察到的來自骨髓的粒細胞，血小板和紅細胞的量卻非常低。而且，小鼠胸腺通常缺乏一些可以完全模擬人T細胞成熟所需要的相應人特異性因子。

3. BLT模型（Bone marrow/liver/thymus)模型， 該模型的建立是通過腎囊和靜脈血管注射，移植人胚胎干和胸腺�？梢孕纬奢^強的人粘膜免疫系統(tǒng)，以及自體同源人胸腺的HLA限制的人T細胞。然而，在許多實驗室實際操作時，小鼠會出現(xiàn)GVHD樣綜合癥，從而限制了實驗窗口期。

每種模型都有其優(yōu)勢與不足，研究者需要根據(jù)自己特殊的研究目的，需要解決的特殊生物學問題，選擇合適的構建方法。

中國實驗動物信息網(wǎng)： 針對目前常用免疫缺陷小鼠模型存在的問題，有哪些改進方法與策略？

俞博士：雖然相對于早期的免疫缺陷小鼠（如SCID, NOD-SCID等），免疫缺陷IL2rg小鼠已經(jīng)具有支持人細胞，組織和免疫系統(tǒng)成功移植的能力。然而，為了進一步改善該模型在實際應用中存在的某些不足，在此類模型基礎上，全球許多實驗室也在為進一步完善免疫缺陷小鼠模型，研發(fā)更加有效的人疾病模型持續(xù)不斷努力著。在這方面的努力主要集中在如何增加有利于人先天免疫系統(tǒng)和體液免疫發(fā)育成熟與功能效果等領域。

為了改善骨髓細胞在免疫缺陷IL2rg小鼠中發(fā)育成熟與功能， 研究者們在BRG小鼠的基礎上，構建了人M-CSF, IL-3, SIRPa, TPO, GM-CSF 基因插入的MISTRG小鼠。該小鼠具有表達功能性的人單核細胞和NK細胞能力，而且，在接受人胎干HSC移植和皮下注射人黑色素瘤細胞系Me290后, M2巨噬細胞如同在原位腫瘤組織一樣，可以侵潤腫瘤微環(huán)境。與Hu-SRC-SCID NSG腫瘤移植小鼠模型相比，腫瘤生長在Hu-SRC-SCID/MISTRG小鼠中是增加的，提示巨噬細胞/骨髓細胞具有促進腫瘤生長的作用。

另外，在NOG小鼠背景添加人GM-CSF和IL3構建的NOG-hGM-CSF/hIL3小鼠，或在NSG小鼠背景上添加人GM-CSF，IL3和SF（Steel factor)構建的SGM3，與NOG/NSG小鼠相比，SGM3小鼠都具有促進來自人的骨髓細胞在小鼠體內(nèi)發(fā)育成熟的作用。

逐步增加的發(fā)展趨勢表明，這些改進的人源化小鼠模型正在被應用于人生物學反應和疾病許多研究，且將成為臨床前藥物評價，以及深入探討人疾病發(fā)生機理潛在機制的重要工具。

中國實驗動物信息網(wǎng)：目前免疫缺陷小鼠存在的問題與挑戰(zhàn)是什么？

俞博士：目前這些免疫缺陷小鼠存在的主要問題，還是因為小鼠自身存在的先天免疫系統(tǒng)及細胞因子，仍然阻擾了人淋巴細胞和骨髓細胞在小鼠體內(nèi)的發(fā)育成熟與功能。為了解決這一問題，已經(jīng)構建了多種敲除小鼠株（包括破壞小鼠粒細胞和巨噬細胞功能等），達到進一步降低小鼠先天免疫的作用。如在移植人HSC后，由于人和小鼠細胞因子的種系特異性，使得人免疫細胞的分化和成熟不完全。針對此現(xiàn)象，也可以通過轉(zhuǎn)基因或敲入等基因修飾技術與方法，將人細胞因子基因?qū)�入免疫缺陷小鼠的基因組DNA中來解決。

應用轉(zhuǎn)基因方法的一個潛在的問題，是可能造成小鼠相應細胞因子基因的干擾，表現(xiàn)為雖然可以發(fā)生相應的結合反應，但卻無法引起人細胞因子的相應靶信號效應。因此，對于許多表達人分子的轉(zhuǎn)基因小鼠，建議同時將小鼠相應細胞因子基因進行敲除修飾。

另外，針對通過增加人細胞因子的改進型人源化小鼠模型（如MISTRG）小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，該類小鼠表現(xiàn)有較嚴重貧血癥狀現(xiàn)象，這與人巨噬細胞對小鼠紅細胞的損傷，以及來自人HSC對小鼠相應HSC的排斥作用可能有關。

而且，人源化小鼠不完整的體液免疫仍然是沒有解決的問題，這可能與缺乏系統(tǒng)的繼發(fā)淋巴細胞結構，包括免疫刺激后，無法形成有效的類轉(zhuǎn)換和親和力成熟等原因，從而限制了體液免疫反應。為了解決此問題，通過增加淋巴組織刺激細胞發(fā)育，但不需要借助IL2-rg受體的信號的研究努力也正在進行。例如，對現(xiàn)有的模型中敲除小鼠MHC類型I和類型II基因的修飾已經(jīng)構建成功，當作為主要供體人PBMC移植小鼠MHC，可以達到降低GVHD發(fā)生。這些努力在總體上，增加了改進型人源化小鼠人免疫細胞移植的成功率及功能性。

中國實驗動物信息網(wǎng)：人源化小鼠模型對人感染性疾病方面研究有哪些幫助？

俞博士：人源化小鼠模型為研究那些具有種系特異性致病源，即需要人組織而發(fā)揮其感染及復制功能，提供了機會與可能性。通過移植人免疫細胞至免疫缺陷小鼠，可以使許多人特異性致病源發(fā)揮感染作用。當然，根據(jù)需要研究解決問題的不同，需要結合不同的小鼠品系和移植方法，選擇最為優(yōu)化動物模型。目前，人源化小鼠已經(jīng)有應用于包括HIV，登革熱病毒，EB病毒，流感病毒，傷寒/沙門氏菌，結核桿菌，埃博拉病毒，瘧疾，敗血癥等感染性疾病的研究報道。

人源化小鼠模型已經(jīng)廣泛應用于人免疫缺陷病毒 （HIV）的研究。1988年應用CB17-SCID 小鼠移植人免疫系統(tǒng)的構建以前，黑猩猩是用于HIV研究的唯一動物模型。 由于HIV感染人CD4 T細胞，巨噬細胞和樹突狀細胞，因而，人源化小鼠模型為體內(nèi)研究HIV不僅提供了可能性，而且已經(jīng)用于HIV感染，疾病發(fā)展過程，潛伏期，以及病毒學等方面研究。 雖然，一些實驗室應用Hu-SRC-SCID模型來研究HIV，但更多的實驗室是用BLT模型，因為這種模型可以獲得移植效率更高的人粘膜系統(tǒng)，從而利于研究HIV在陰道和腸道的傳播機制。這類模型已經(jīng)應用于各種HIV預防性藥物的測試，抑制HIV復制及其清除的細胞治療的評估。

應用Hu-PBL-SCID小鼠最早在體內(nèi)揭示了HIV感染，復制和致病性，而HSC-移植和BLT模型則再現(xiàn)了人感染疾病過程。HSC移植的免疫缺陷小鼠可以被CCR5或CXCX4-熱帶HIV株感染，表現(xiàn)為較長時間（超過一年）的血清病毒血癥。BLT模型已成為研究HIV突變導致逃逸CD8 T細胞應答的有用模型。

為了努力重現(xiàn)因移植了CCR5缺失供體的骨髓能達到治愈HIV“柏林病人”現(xiàn)象，有許多研究專注于用抑制CCR5表達的HSC進行小鼠移植實驗。如用ZFN技術對HSC中CCR5進行基因打靶修飾，導致CD4 T細胞的損失減少及HIV病毒拷貝數(shù)的下降。也有研究者應用慢病毒技術，將特異性作用于CCR5的相應microRNA導入至HSCs, 然后將修飾的HSCs移植NSG小鼠，發(fā)現(xiàn)這些小鼠表現(xiàn)為人CD4陽性T細胞的存在和病毒量的降低，表明該小鼠對CCR5熱帶HIV株感染具有抵抗性。

另外，也有通過構建同時針對CCR5和CXCR4熱帶病毒的雙靶點HIV慢病毒表達載體，達到不僅可以下調(diào)CCR5，且有可以抵抗CXCR4熱帶病毒的作用。應用該雙靶點載體轉(zhuǎn)染的人HSCs來建立NSG-BLT人源化小鼠, 結果表明，來自這些小鼠的脾細胞具有在體外抵制CCR5和CXCR4熱帶病毒感染的作用。

中國實驗動物信息網(wǎng)：人源化小鼠在人鼠嵌合肝小鼠模型應用中有什么意義？

俞博士：通過建立了人肝嵌合體小鼠模型，可為了研究人肝臟致病因子（如丙型肝炎，乙型肝炎和丁型肝炎等病毒）提供可能性。應用這類模型的常用策略是首先破壞小鼠的肝細胞，使其為移植人肝細胞提供空間。例如，通常的模型是通過破壞延胡索酰乙酰乙酸水解酶（Fah）。另外的方法是，通過表達可調(diào)控的所謂“毒性/自殺”基因，如尿激酶型纖溶酶原激活子（uPA), 白喉毒素受體（DTR），以及單純皰疹病毒1型胸苷激酶（TK）等基因，發(fā)揮其對肝細胞的特異性損傷作用。

丙型肝炎病毒（HCV）是引起慢性感染，進行性肝硬化，以及導致肝細胞癌癥的重要誘發(fā)因素。目前，SCID/Alb-uPA和Fah Rag2 IL2rg小鼠已經(jīng)應用HCV的研究。近年來更多的研究是利用白蛋白（Alb) 啟動子控制FKBP-capase8融合蛋白（AFC8）表達的BRG小鼠，通過利用AP20187來去除活性Caspase8的二聚作用，使移植人肝細胞和HSCs成為可能。研究表明，人肝嵌合小鼠可以被HCV感染，引起人病毒特異性T細胞對HCV的應答及肝纖維化。但是，HCV復制在小鼠體內(nèi)只觀察到約50%，提示為了能更有效地研究HCV致病性與免疫性，仍需要建立更加優(yōu)化改進的小鼠模型。

HCV進入細胞需要通過Claudin-1受體密切接觸介導實現(xiàn)，用人肝嵌合uPA-SCID小鼠研究發(fā)現(xiàn)，針對該受體的阻斷抗體可達到抑制病毒復制，降低感染肝細胞數(shù)量的作用。另外，在NRG-Fah小鼠中，借助AAV載體表達針對多個HCV特異性的中和抗體聯(lián)合應用的療法，也具有降低HCV復制和病毒感染量的作用。而且，用MUP（Major urinary protein)啟動子表達uPA 建立MUP-uPA/SCID/beige小鼠，應用該模型研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染可引起約25%的感染小鼠形成原發(fā)性肝腫瘤，這為研究肝腫瘤的形成機制提供了獨特的機會。

另外，人鼠肝嵌合小鼠模型也可應用于藥物代謝的研究。許多藥物是通過肝臟進行代謝，小鼠和人肝的代謝機制是明顯不同的。因此，簡單應用小動物模型研究藥物代謝動力學顯然是不適合的。目前，許多人鼠嵌合肝模型就是通過破壞小鼠肝細胞的方式，結合脾內(nèi)注射人肝細胞來開展的。例如，一種新型免疫缺陷小鼠是通過利用白蛋白（Alb) 啟動子控制表達白喉毒素受體（DTR），構建Alb-TRECK/SCID小鼠。當注射白喉毒素后，小鼠肝臟很快被破壞，然后用人肝細胞取而代之。這類人鼠肝嵌合小鼠模型具有如同人肝一樣的藥物代謝特征。由于種系的不同造成的原因， 可用于人的藥物如利尿磺胺，對小鼠則是有毒性的。然而，應用人肝嵌合的TK-NOG小鼠則有有助于解決這一問題，并應用于人藥物的毒性試驗。如研究表明，利尿磺胺藥物對TK-NOG小鼠的毒性作用降低，與在人體內(nèi)觀察的副反應相似。

中國實驗動物信息網(wǎng)：人源化小鼠在腫瘤生長和癌癥免疫學等研究領域有哪些方面應用？

俞博士：在過去的50多年時間，研究者們通過將來自病人腫瘤移植到無胸腺裸鼠及SCID免疫缺陷小鼠的研究方法，已經(jīng)成為驗證與評估人癌癥疾病治療效果方面非常有價值的工作。不幸的是，無胸腺裸鼠仍然保留了小鼠的先天免疫系統(tǒng)和B細胞，特別是保留能抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的小鼠NK細胞。而包括缺失NK細胞的免疫缺陷IL2rg小鼠的建立，則有利于成功移植各種人腫瘤，包括腫瘤細胞系，原位實體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤等領域的研究及應用。

腫瘤病人來源的異種移植（PDX）至免疫缺陷IL2rg小鼠，可以實現(xiàn)保留原位腫瘤的異質(zhì)性和基質(zhì)效果。由于PDX小鼠中存在有人腫瘤侵潤免疫細胞，該模型成為腫瘤微環(huán)境中的非自發(fā)的異質(zhì)性現(xiàn)象的貢獻之一。因此，免疫缺陷IL2rg小鼠為研究腫瘤與免疫系統(tǒng)相互作用提供了機會，研究者們可以通過移植人腫瘤細胞及免疫系統(tǒng)至免疫缺陷小鼠，探索腫瘤是如何與免疫系統(tǒng)相互作用，腫瘤免疫逃逸的機制，免疫調(diào)節(jié)潛在療法的機理。當然，PDX腫瘤經(jīng)過再次傳代后，迅速損失原腫瘤基質(zhì)，而被小鼠基質(zhì)細胞所替代。

基于腫瘤細胞系在人源化小鼠模型而獲得的腫瘤及免疫系統(tǒng)相互作用的相關結果，由于其缺乏腫瘤異質(zhì)性等因素，因而存在一定的應用局限性。而進一步改進的腫瘤模型如PDX腫瘤模型則有助于解決這方面的不足，因為原位移植的PDX腫瘤模型可以實現(xiàn)腫瘤組織的異質(zhì)性與更加完整腫瘤微環(huán)境相結合的目的。

然而，如何獲得足夠量的自體同源的HSCs開展大批量的研究，則是構建人源化小鼠應用于PDX研究中一個潛在不利因素。最近，一種從臍帶血或G-CSF刺激并轉(zhuǎn)染tat-MYC和tat-Bcl2融合蛋白的PBL，分離獲得擴增的HSCs的方法，可以在體外擴增HSCs。如XactMice， 即將經(jīng)體外擴增的HSCs移植的NSG小鼠， 再移植來自頭頸部體鱗狀細胞癌（HNSCC）病人的PDX樣品，腫瘤在此類小鼠中有人CD45陽性CD151陽性細胞，以及增加的淋巴血管密度，提示在小鼠的腫瘤微環(huán)境中人免疫細胞和基質(zhì)細胞已經(jīng)再生形成。

人源化小鼠應用T細胞編輯方面的研究也已成為現(xiàn)實。一種通過作用于免疫系統(tǒng)達到改善抗腫瘤免疫的機制，是通過導入TCR或嵌合抗原受體（CAR）基因改造T細胞方法，達到重新提升T細胞特異性的T細胞療法。CAR療法是基于構建針對特異性抗原T細胞受體，該抗原受非依賴于MHC限制，使得TCR被引導至選擇的任何靶點。雖然，T細胞再定位的療法已經(jīng)用于臨床，人源化小鼠模型則可作為優(yōu)化TCR/CAR調(diào)節(jié)的藥效及安全，以及擴大癌癥治療范圍等的評估方法。

將腫瘤特異性TCR通過轉(zhuǎn)基因（Tg) 方式導入T細胞的優(yōu)化機制，已經(jīng)在人源化小鼠模型進行了研究。關于Tg TCR療法的安全性考慮問題，是Tg TCR與內(nèi)源性TCR之間可能發(fā)生錯誤配對，引起脫靶特異性，從而增加了細胞毒性。有研究者利用ZFN方法將內(nèi)源性TCRa和TCRb基因破壞后，表明在移植源WT-1陽性白血病的Hu-PBL-SCID模型中，編輯的Tg T細胞具有只表達WT-1腫瘤特異性TCRs。

人源化小鼠也可作為免疫檢查點抑制劑的評價工具。利用檢查點抑制劑的作用機制作為腫瘤免疫調(diào)節(jié)療法，已經(jīng)成為當前最具潛力的研究領域。 目前在臨床上成功研制的兩個免疫檢查點單克隆抗體，如抗細胞毒T淋巴細胞抗原4（CTLA-4）單抗， 該抗體具有阻斷抑制通路，激活T細胞的作用；和抗程序化細胞死亡-1（anti-PD-1)單抗，可以達到阻斷PD-1與其程序化細胞死亡-配體1（PD-L1）相互作用。這些阻斷作用在抵抗黑色素瘤方面都具有明顯效果，但不是所有的病人對CTLA-4和抗PD-1治療都有反應。因此，移植腫瘤的人源化小鼠被應用，可以成為更好地揭示阻斷與免疫系統(tǒng)之間的相互作用機制，以及測試與評價免疫調(diào)節(jié)劑效果與效率的工具。

最近的研究表明，應用人源化小鼠分析免疫調(diào)節(jié)抗體的藥物動力學，以及抗腫瘤的特性，如在人結直腸HT-29癌細胞和異源人PBMCs移植的Rag2 IL2rg小鼠中，或移植病人來源的胃癌組織及自體PBMCs的小鼠，利用抗hCD137和抗PD-1單抗聯(lián)合作用具有顯著降低腫瘤生長的效果。

中國實驗動物信息網(wǎng)：應用基因修飾方法建立人源化小鼠模型有哪些基本技術方法？賽業(yè)模式生物在這方面有什么優(yōu)勢與貢獻？

俞博士：前面介紹的人源化小鼠模型多是基于免疫缺陷小鼠基礎上，通過移植人細胞和組織實現(xiàn)的。通過基因修飾的技術方法，將人相關基因直接替換小鼠相關基因，建立人源化小鼠模型的方式，也已廣泛應用于人基因功能研究、腫瘤免疫藥物研發(fā)、感染性疾病建立以及藥物臨床前評估與考核等生物醫(yī)藥領域研究。比如，通過對免疫檢查點相關的小鼠基因（如CTLA4和PD1等）進行人源化修飾，構建能與抗CTLA4和PD1人源化抗體相互作用的人源化小鼠，為這類抗體藥物的臨床前篩選與評估提供了有效的工具。通過對不感染小鼠，但感染人病原體感染分子機理的研究，探索建立可被這些病原體感染的人源化小鼠模型，為在小鼠體內(nèi)研究其發(fā)病過程，建立有效疾病的防御與治療評價體系提供了可能性。如基于對引起中東呼吸道綜合癥（MERS)的冠狀病毒感染人細胞的分子機制研究的基礎上，利用基因打靶技術，將冠狀病毒感染結合人細胞DPP4基因替換小鼠的相應基因，構建了人源化DPP4敲入小鼠，研究表明，該人源化小鼠對冠狀病毒具有易感性，并可作為篩選評估MERS相應中和抗體效果的工具。

另外，近年來在人源化抗體制備的快速發(fā)展中，利用基因修飾的方法構建可制備人抗體的人源化小鼠，已經(jīng)成為抗體藥物研發(fā)的重要研究領域。其中最為成功的例子為美國Regeneron制藥公司研發(fā)的VelocImmune小鼠。該人抗體人源化小鼠的制備策略是通過多輪基因打靶操作過程，分別用人抗體重鏈/輕鏈可變區(qū)替換小鼠同源區(qū)域獲得。該人源化小鼠在受到相應抗原刺激后，可生產(chǎn)針對特異性抗原的含人抗體可變區(qū)部分，以及小鼠抗體恒定區(qū)的人源化抗體。研究表明，與其他體外DNA重組方法獲得的人抗體比較，這類通過人源化小鼠篩選獲得人抗體具有更佳有效的親和力與活性。

目前，應用基因修飾的方式構建人源化小鼠模型的技術方法主要有以下幾種，1. 借助原核注射的方法，將人基因?qū)�入小鼠體內(nèi)，達到表達人基因的目的；2. 利用小鼠ES細胞系，進行傳統(tǒng)基因打靶的方法，達到用人基因定點替換小鼠基因或插入人基因的目的；3. CRISPR/Cas9基因組編輯技術，通過原核注射方式，構建特殊目的的人源化小鼠模型；4. Turobo KO優(yōu)化的ES打靶技術，該技術是賽業(yè)生物對傳統(tǒng)ES打靶技術進行優(yōu)化，使其在構建人源化小鼠模型的研制中更加高效穩(wěn)定。由于以上幾種技術方法都有其各自的優(yōu)勢與不足，因此，在實際應用中，需要根據(jù)各自的研究需要與目的選擇更加適合方法。比如，雖然原核注射的轉(zhuǎn)基因構建方法本身方便，快速，成本低，但因DNA隨機插入的特性，可能對內(nèi)源性基因干擾引起的風險，以及插入位置效應對基因表達的可能抑制影響，可能導致對以后研究帶來的不確定性因素。傳統(tǒng)基因打靶技術因其成熟性與穩(wěn)定性，一直都是基因修飾小鼠制備的金標準，然而，由于該方法技術要求較高，操作步驟多而復雜，使其制備周期相對較長，也不利于其推廣應用。CRISPR/Cas9技術因其設計與操作相對簡單，對一般基因修飾的效率高，且沒有物種限制的特性，大大促進了其在人源化模式動物模型的研制。當然，因為存在脫靶效應，以及對復雜修飾效果難控制等風險也在一定程度上限制該技術等應用。在傳統(tǒng)ES打靶技術的基礎上，賽業(yè)生物經(jīng)過多年的探索努力，推出的Turobo KO基因打靶技術，包括建立生殖遺傳高效的TetraOne ES細胞系，以及Neo抗性篩選基因自刪除系統(tǒng)等技術改進，不僅保留了傳統(tǒng)基因打靶技術的穩(wěn)定性與成功率，而且提高其制備過程的有效性，使ES打靶技術的制備周期大大縮短。因此，賽業(yè)生物Turobo KO基因打靶技術的建立，將更加有助于構建相對復雜的基因修飾人源化小鼠模型，為應用基因修飾技術制備不同類型的人源化小鼠模型提供了更多的選擇。目前，Turobo KO基因打靶技術的建立也是賽業(yè)生物有別于其他同類供應商的明顯優(yōu)勢之一。

中國實驗動物信息網(wǎng)：人源化小鼠模型的研究與應用未來需要解決的問題是什么？

俞博士：對建立在免疫缺陷小鼠基礎上的人源化小鼠模型需要從以下幾個方面進一步的改進與優(yōu)化，1. 降低小鼠的先天免疫，使其達到更加有效的移植具有功能性的人細胞，組織和免疫系統(tǒng)，表達人分子，如能于供體人細胞相配的HLA等位基因，從而更加有利于人免疫發(fā)育和功能；2. 構建有助于免疫缺陷IL2rg小鼠的人相關淋巴結構（如含生發(fā)中心的淋巴結）發(fā)育，使人造血干細胞成為發(fā)揮完整功能性人免疫反應；3. 研究尋找與替換人免疫系統(tǒng)形成相關的特異性因素，因為這些因素可能是小鼠自身缺乏的，但卻是理想人細胞分化與功能需要的；4. 進一步評估與驗證PDX和PDX/免疫模型應用實際效果，使其實現(xiàn)能真實反映病人腫瘤微環(huán)境與免疫系統(tǒng)相互作用的機制，為探索新的有效腫瘤免疫治療方法與策略提供依據(jù)和基礎；5. 由于移植物抗宿主疾病在許多人免疫移植模型中都會發(fā)生，因此，建立降低或防止移植物抗宿主疾病發(fā)生的有效方法，為人源化小鼠模型作為有效的臨床前研究的工具，以及未來新藥開發(fā)與應用創(chuàng)造了條件。

而對于基因修飾人源化小鼠模型研制，如何篩選到合適有效的相關靶基因，對修飾靶基因自身的結構，剪切及表達特點的深入了解，基因修飾打靶策略的選擇，以及對目前不同基因修飾技術與方法的改進與優(yōu)化等因素，都將是基因修飾人源化小鼠模型未來需要探索解決的問題。

總之，人源化小鼠模型等建立促使了人感染性疾病，癌癥，再生醫(yī)學，移植與宿主，過敏和免疫等領域的研究發(fā)展。利用人源化小鼠模型最終有可能實現(xiàn)臨床上真正“個性化” 醫(yī)療的目的。

中國實驗動物信息網(wǎng)：非常感謝俞博士接受中國實驗動物信息網(wǎng)的特邀專訪。

來源: 中國實驗動物信息網(wǎng)