【示蹤】利用DeaLT技術揭示成人心肌細胞再生的來源

策略1 Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1 非肌細胞對成體心臟中的肌細胞沒有貢獻

使用Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠來同時追蹤成體心臟中的心肌細胞和非心肌細胞。tdTomato、ZsGreen和TNNI3的免疫染色顯示tdTomato+細胞是TNNI3+心肌細胞，而ZsGreen+細胞不是TNNI3+心肌細胞（圖1G）。 分離Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1的心肌細胞進行體外觀察也沒有檢測到ZsGreen+心肌細胞（圖1H）。 因此，Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1系統(tǒng)用兩種不同的熒光標記了肌細胞和非肌細胞（圖1I）。

圖1.G-I

非肌細胞在成體心臟中是否會分化成肌細胞呢？如果是，那么源自非肌細胞的新心肌細胞將是ZsGreen+的。而實驗結果是：在Dox誘導后，對Tnnt2-Dre; R26-iCre; IR1小鼠進行結扎左前降支冠狀動脈誘導MI造模（圖2A）。心肌梗塞后，造成心肌細胞大量死亡，心臟功能受損，在損傷后2-4周，對心臟切片進行ZsGreen、tdTomato和TNNI3免疫染色，結果沒有發(fā)現(xiàn)ZsGreen+TNNI3+的心肌細胞（圖2B）。在5個心梗組織的600多個切片中，都沒有檢測到ZsGreen+tdTomato-心肌細胞。流式細胞分析（圖2D）和熒光顯微鏡（圖2E）也證實在Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠的MI造模后的心臟中也沒有觀察到ZsGreen+心肌細胞。RT-PCR結果也只有tdTomato的表達，沒有ZsGreen的mRNA表達（n=5，圖2F）。這些數(shù)據(jù)表明，非心肌細胞在成體心臟的心臟損傷后對肌細胞沒有貢獻。

圖2. A-F

平行地，將骨骼肌損傷后骨骼肌中非肌細胞向肌細胞的細胞命運轉化作為陽性對照。骨骼肌在穩(wěn)態(tài)維持過程中，肌纖維細胞與非肌肉細胞發(fā)生融合，肌纖維細胞處于多核狀態(tài)，因此在正常骨骼肌（假手術組）中，可以檢測到tdTomato+ ZsGreen+肌細胞（圖2G）。而當對Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1小鼠的脛骨前肌（TA�。�實施BaCl2損傷后，骨骼肌中肌纖維細胞大量死亡，TA肌損傷后可以檢測到弱tdTomato熒光信號和強ZsGreen表達，表明在BaCl2造模后ZsGreen+細胞逐漸取代tdTomato+細胞（圖2G）。與假手術組相比，在受損TA肌中可以檢測到ZsGreen+tdTomato-肌細胞（箭頭，圖2G），說明非肌細胞重新形成肌細胞。

圖2. G

綜合上述結果，通過Tnnt2-Dre;R26-iCre;IR1（策略1）的雙同源重組譜系示蹤技術揭示了在胚胎心臟和成體骨骼肌中非肌細胞向肌細胞的轉化，但在成體心臟中非肌細胞對肌細胞沒有貢獻。

策略2 Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3 反向Cre/Dre 系統(tǒng)在非肌細胞向肌細胞轉化研究中標記兩種細胞

設計第2個雙同源重組譜系示蹤系統(tǒng)用來驗證非肌細胞向肌細胞的轉化。該系統(tǒng)由Tnnt2-Cre（肌細胞中表達Cre）、他莫昔芬誘導型 R26-DreER 和IR3報告小鼠組成。利用IR3報告小鼠（見下圖）可排它性地將非肌細胞標記上tdTomato紅色熒光，將肌細胞特異性地標記上ZsGreen綠色熒光。

Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3小鼠就可以同時標記肌細胞（ZsGreen+）和非肌細胞（tdTomato+）（圖3A）。

圖3. A

胚胎E8.0天心臟中ZsGreen主要標記原始心管（圖3B）。E8.0天給予他莫昔芬誘導，在E13.5天的右心室中發(fā)現(xiàn)tdTomato+非肌細胞對肌細胞有顯著貢獻（圖3C）。心臟切片免疫染色也證實了此結果（圖3D-F）。

同樣，在成體心臟和骨骼肌中，通過MI和BaCl2造模來觀察非心肌細胞的命運轉化（圖3G）。分離的心肌細胞的流式細胞分析（圖3H）和熒光顯微鏡（圖3I）分別結果也都顯示沒有tdTomato+心肌細胞。在形態(tài)上，這些tdTomato+細胞與ZsGreen+心肌細胞也明顯不同（圖3J）。

tdTomato和TNNI3免疫染色顯示這些tdTomato+細胞在MI心臟的梗塞區(qū)、邊界區(qū)和遠端區(qū)均不會轉化為TNNI3+心肌細胞（圖3K）。來自5個Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3小鼠心臟的超過600個組織切片中均未檢測到tdTomato+TNNI3+心肌細胞。RT-PCR結果也同樣指出分離的心肌細胞只表達ZsGreen，不表達tdTomato（圖3L）。

相反，在陽性對照實驗中，TA肌損傷模型中他莫昔芬誘導后可以很容易地檢測到tdTomato+ZsGreen-肌細胞（箭頭，圖3M），而假手術組沒有。

圖3.

綜合上述結果，第2種策略使用Tnnt2-Cre;R26-DreER;IR3也顯示出與策略1一致的結果：非心肌細胞在胚胎心臟和成體骨骼肌中轉化為肌細胞，但在成體心臟中對肌細胞沒有貢獻。

策略3 Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1

為了進一步驗證上述發(fā)現(xiàn)，使用另一種肌細胞Marker——TNNI3來驅動Dre重組酶。 Tnni3-Dre在成體心臟中有效且特異性標記肌細胞，但不標記非肌細胞。利用Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1小鼠，分別標記肌細胞和非肌細胞（圖4A）。

圖4. A

通過ZsGreen、tdTomato和不同心臟細胞譜系marker的免疫染色顯示肌細胞表達tdTomato、非肌細胞（例如內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等）表達ZsGreen（補充材料）。不給予Dox誘導的情況下，在Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1小鼠中未觀察到ZsGreen+細胞組織（圖4B）。

給予Dox后兩周，進行MI或BaCl2注射（圖4C），結果發(fā)現(xiàn)在假手術的心臟中，Dox誘導后使tdTomato+心臟細胞也被標記上ZsGreen綠色熒光（圖4D）。tdTomato、ZsGreen和TNNI3的免疫染色顯示所有心肌細胞均為tdTomato+ZsGreen-（圖4E）。MI造模后，梗塞的心臟組織中tdTomato+肌細胞數(shù)量明顯減少，被ZsGreen+非肌細胞替代（圖4F）。

分離MI造模后的心肌細胞體外觀察均為tdTomato+ZsGreen-細胞（圖4G）。 tdTomato、ZsGreen和TNNI3免疫染色顯示ZsGreen+細胞在損傷后并沒有轉向心肌細胞命運（圖4H，I）。通過分流式細胞分析和RT-PCR沒有檢測到MI心臟中有任何ZsGreen+tdTomato-肌細胞（圖4J，K）。

相反，在陽性對照實驗中，在損傷的TA肌肉中可以檢測到ZsGreen+tdTomato-肌細胞（箭頭，圖4L），表明非肌細胞新生為肌細胞。

圖4.

所以，基于Tnni3-Dre;R26-iCre;IR1的第3種模型也揭示了在成體心臟中非肌細胞并不轉化為肌細胞。

策略4 Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1 通過NR1系統(tǒng)研究非肌細胞向肌細胞的轉化

雖然利用廣泛型啟動子驅動的可誘導Cre或Dre可以有效標記大多數(shù)非肌細胞，但實際上標記效率并未達到100％。少數(shù)未標記的非肌細胞在損傷后在成體心臟中產(chǎn)生新的肌細胞也仍舊是有可能的，雖然可能性并不大，因為在譜系示蹤期間的標記過程是完全隨機的。為了達到100％的非肌細胞標記效率，利用NR報告基因小鼠（見下圖），設計了第4種策略。

在這個系統(tǒng)中，ZsGreen標記小鼠所有的細胞，除了被tdTomato標記的新形成的肌細胞。Actb-Cre-loxP重組之后NR1小鼠中的所有細胞首先被標記為ZsGreen綠色熒光，只有新的肌細胞在形成時由于第二個Tnnt2-Dre-rox的重組而開啟tdTomato紅色熒光的標記（圖5A）。綠色熒光蛋白在哺乳動物細胞中有12-24小時的半衰期，所以盡管肌細胞中的Dre-rox重組會導致tdTomato表達，但ZsGreen蛋白在降解前仍有穩(wěn)定的標記時間。因此可以在非肌細胞向肌細胞轉化期間檢測到雙陽性細胞。

圖5. A

首先分析之前實驗中的胚胎心臟（圖5B）來測試這個系統(tǒng)。很容易在E8.5天發(fā)育的心臟流出道中檢測到tdTomato+ZsGreen+肌細胞（箭頭，圖5C），這與以前的研究結果一致，表明第二心區(qū)祖細胞在這個階段分化成心肌細胞。

然后，在MI造模28天期間每12小時間隔收集小鼠心臟樣本進行分析（圖5B）。對于ZsGreen、tdTomato和TNNI3免疫染色，結果顯示在梗塞心肌中沒有ZsGreen+tdTomato+肌細胞（圖5D）。所有56個時間點的Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1小鼠心臟樣本，超過6000個心臟切片中未檢測到任何ZsGreen+tdTomato+肌細胞。類似地，分離心肌細胞進行流式細胞分析在ZsGreen+細胞中也沒有發(fā)現(xiàn)肌細胞（圖5E）。

相反，陽性對照實驗中很容易在受損TA肌肉中檢測到ZsGreen+tdTomato+肌細胞（圖5F）。在Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1小鼠心臟切片中非肌細胞100%被ZsGreen標記（補充材料）。

圖5.

綜上所述，使用基于Tnnt2-Dre;Actb-Cre;NR1的第4種譜系示蹤策略的結果顯示，非肌細胞向肌細胞的轉化只在胚胎期而不在成體心臟中出現(xiàn)。