氧化型谷胱甘肽含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

粗酶液提�。�

1.組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清液（如上清不清澈，再離心 3min）待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；8000g 4℃離心 10min，取上清液（如上清不清澈，再離心 3min）混勻待測(cè)。

3. 血清等液體：直接測(cè)定。

GSSG 含量測(cè)定：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 412nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三置于 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中保溫 30min。

3. 測(cè)定管：取 1 mL EP 管，加入 20μ L 上清液，1 μ L 試劑二，蓋緊后混勻，置于 37℃水浴30min；開(kāi)蓋后依次加入 20 μ L 試劑四，140 μ L 試劑五，2 μ L 試劑六，迅速混勻后，測(cè)定30 s 和 150 s 光吸收 A1 和 A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

GSSG 含量計(jì)算公式：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y=0.0325x+0.046；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y 為吸光值(ΔA)。

2、 按蛋白濃度計(jì)算

GSSG（nmol/mg prot）=(ΔA-0.046)÷0.0325×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×Cpr)

=30.77×(ΔA-0.046)÷Cpr

3、按樣本鮮重計(jì)算

GSSG（nmol /g 鮮重）=(ΔA-0.046)÷0.0325×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)

=30.77×(ΔA-0.046)÷W

4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

GSSG（nmol/104 cell）=(ΔA-0.046)÷0.0325×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)

=30.77×(ΔA-0.046)÷細(xì)胞數(shù)量

5、按照液體體積計(jì)算

GSSG（nmol/mL）=(ΔA-0.046)÷0.0325×V 樣÷V 樣

=30.77×(ΔA-0.046)

V 樣：反應(yīng)中加入樣本體積，20μL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質(zhì)量，g，

Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y=0.016x+0.023；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y 為吸光值(ΔA)。

2、 按蛋白濃度計(jì)算

GSSG（nmol/mg prot）=(ΔA-0.023)÷0.016×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×Cpr)

=61.54×(ΔA-0.023)÷Cpr

3、按樣本鮮重計(jì)算

GSSG（nmol /g 鮮重）=(ΔA-0.023)÷0.016×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)

=61.54×(ΔA0.023)÷W

4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

GSSG（nmol/104 cell）=(ΔA-0.023)÷0.016×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)

=61.54×(ΔA-0.023)÷細(xì)胞數(shù)量

5、按照液體體積計(jì)算

GSSG（nmol/mL）=(ΔA-0.023)÷0.016×V 樣÷V 樣

=61.54×(ΔA-0.023)

V 樣：反應(yīng)中加入樣本體積，20μL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質(zhì)量，g，

Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）

注意事項(xiàng)：

1. 提取過(guò)程中去掉蛋白質(zhì)，所以提取液不能用于測(cè)定蛋白含量。

2. 臨用前配制的試劑配好后 4℃保存，2 天內(nèi)使用完畢。

3. 最低檢出限為 0.1μmol/L。

4. 反應(yīng)溫度.嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，為保證重復(fù)性，應(yīng)在 25℃下進(jìn)行反應(yīng)。

5. 反應(yīng)時(shí)間需精確控制，否則會(huì)影響反應(yīng)速率計(jì)算，產(chǎn)生較大誤差。

6. 樣品中的 GSSG 濃度盡可能低一些，否則反應(yīng)速率太大，沒(méi)法控制，所以稀釋倍數(shù)要盡量大些。