動(dòng)物骨髓中性粒細(xì)胞分離液試劑盒使用說明

各種動(dòng)物骨髓中性粒細(xì)胞分離液試劑盒

規(guī)格：200 mL/kit

保存：本產(chǎn)品對(duì)光敏感，應(yīng)該室溫避光儲(chǔ)存，保質(zhì)期 2 年。無菌開封后，保存于室溫。

試劑盒組成：

試劑A 200mL

試劑C 100mL

細(xì)胞洗滌液 200mL

全血及組織稀釋液 200mL

紅細(xì)胞裂解液 100mL

操作步驟：

• 制備骨髓的單細(xì)胞懸液。
• 細(xì)胞懸液體積小于5mL時(shí)，在離心管中先加入4mL試劑A，后將2mL試劑C小心疊加于試劑A之上，形成梯度界面（細(xì)胞懸液體積大于等于5mL，試劑A與試劑C比例2：1，試劑總量與稀釋后的樣本量相等。但二者的總體積不能超過離心管的三分之二，否則會(huì)影響分離效果），將細(xì)胞懸液平鋪到分離液液面上方，注意保持兩液面界面清晰。（可以使用巴

氏德吸管吸取細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液小心的平鋪于分離液上，因?yàn)閮烧叩拿芏炔町�，將形成明顯的分層界面。如果樣品較多，加樣的時(shí)間較長，在離心之前出現(xiàn)紅細(xì)胞成團(tuán)下沉屬正常現(xiàn)象。）

3. 室溫，水平轉(zhuǎn)子500~1000g，離心20~30min（細(xì)胞懸液的體積越大所需的離心力越大，離心時(shí)間越長，最佳的分離條件

需摸索，離心轉(zhuǎn)速最大不超過1200g）。

• 離心后，離心管中將出現(xiàn)兩層環(huán)狀乳白色細(xì)胞層，上層細(xì)胞為單個(gè)核細(xì)胞層，下層細(xì)胞為中性粒細(xì)胞層，如圖所示（個(gè)體差異或者是分離條件不同，粒細(xì)胞層可分離不明顯）。
• 用吸管小心吸取試劑C與試劑A之間以及試劑A中的中性粒細(xì)胞到15mL潔凈的離心管中，10mL PBS或細(xì)胞洗滌液洗滌細(xì)胞。250g，離心10min（如有紅細(xì)胞混雜則加入適量紅細(xì)胞裂解液）。
• 棄上清，5mL的PBS或細(xì)胞清洗液重懸細(xì)胞，250g，離心

10min。

• 重復(fù)步驟6
• 棄上清，細(xì)胞重懸備用。

骨髓單細(xì)胞懸液的制備方法

小動(dòng)物骨髓的采集：

稀釋液

單個(gè)核細(xì)胞層試劑C

中性粒細(xì)胞層試劑A

紅細(xì)胞層

1. 處死動(dòng)物，無菌提取股骨和脛骨，剪去兩端軟骨，露出紅色的骨髓腔（注意盡可能少的剪走骨髓腔）。

2. 取1ml的無菌注射器，吸取少量的含有10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的稀釋液或者是含有血清的培養(yǎng)基，沖洗骨髓腔以獲得骨髓。