追根溯源：細(xì)說(shuō)靶向重測(cè)序與擴(kuò)增子捕獲技術(shù)

追根溯源：細(xì)說(shuō)靶向重測(cè)序與擴(kuò)增子捕獲技術(shù)

Thermo 與 Illumina合作的消息公布之后，在生物醫(yī)學(xué)界投下了一顆重磅炸彈，Ion Ampliseq也一下子成為網(wǎng)絡(luò)熱搜詞。Ion Ampliseq這個(gè)技術(shù)究竟是什么？它有什么獨(dú)特之處？為什么這個(gè)技術(shù)會(huì)造成轟動(dòng)性的效應(yīng)呢？讓我們追根溯源，從NGS說(shuō)起。

NGS，即下一代測(cè)序技術(shù)（Next-generation sequencing technology）又稱(chēng)高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencing），以能一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定但讀長(zhǎng)一般較短為標(biāo)志。

NGS技術(shù)正逐年成熟，這使得全基因組測(cè)序的成本越來(lái)越低，但是對(duì)全基因組進(jìn)行測(cè)序后得到的極其龐大、繁雜的數(shù)據(jù)量的分析工作并沒(méi)有隨之一起變得更加簡(jiǎn)單，恰恰相反，更高的測(cè)序深度反而導(dǎo)致最后的數(shù)據(jù)量變得更加龐大了,分析工作也變得更加困難。于是，測(cè)序技術(shù)的發(fā)展出現(xiàn)了兩個(gè)極端的方向：一種是大而全的全基因組測(cè)序，一種是小而精的靶向重測(cè)序。

相比于全基因組測(cè)序（WGS），靶向重測(cè)序技術(shù)直接從樣品中對(duì)感興趣的基因組區(qū)域進(jìn)行分離測(cè)序。這種方式能夠更加高效且經(jīng)濟(jì)地發(fā)揮NGS技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，后續(xù)的分析速度也會(huì)有跨越性的提升。比如外顯子組僅占基因組的1%左右，但卻包含了絕大部分的已知致病突變，將外顯子區(qū)域分離出來(lái)后單獨(dú)進(jìn)行測(cè)序，后續(xù)的分析就能降低99%的工作量，極大的加快了分析的速度。

在遺傳突變、腫瘤篩查等領(lǐng)域，靶向重測(cè)序所能達(dá)到的靈敏度也是全基因組測(cè)序完全無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。由于靶向重測(cè)序在測(cè)序前就對(duì)基因的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行了分離與富集，目標(biāo)區(qū)域的大幅減少可實(shí)現(xiàn)5000×甚至更高的測(cè)序深度。測(cè)序深度的提高意味著更高的靈敏度（能夠檢測(cè)低頻率的變異），其檢測(cè)極限低至0.1%。

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靶向重測(cè)序中，目標(biāo)片段的富集主要由兩種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)：雜交捕獲和擴(kuò)增子捕獲。

○●○ 雜交捕獲技術(shù)

通過(guò)設(shè)計(jì)與目標(biāo)片段互補(bǔ)的生物素化探針，使其與含目的基因的片段進(jìn)行雜交，以達(dá)到將目的基因片段富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的目的。根據(jù)支持物的不同，探針雜交捕獲技術(shù)分為液相雜交與固相雜交兩種。固相雜交由于其在花費(fèi)與操作上的劣勢(shì)，已基本被淘汰；液相雜交是在溶液中，目標(biāo)片段和帶有生物素標(biāo)記的探針直接雜交，然后利用被鏈霉親和素包裹的磁珠對(duì)雜交了生物素探針的片段進(jìn)行吸附。洗去游離DNA后，將富集得到的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)。

○●○ 擴(kuò)增子捕獲技術(shù)

擴(kuò)增子捕獲測(cè)序技術(shù)是一種目標(biāo)區(qū)域高通量測(cè)序技術(shù)，利用特異性引物來(lái)對(duì)感興趣的DNA區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，形成高度富集的DNA庫(kù)，將PCR產(chǎn)物純化后再進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序。篇首所述的Ion Ampliseq技術(shù)便歸屬于擴(kuò)增子捕獲技術(shù)。

擴(kuò)增子捕獲測(cè)序助力臨床研究加速

對(duì)臨床或轉(zhuǎn)化研究而言，檢測(cè)不僅要準(zhǔn)確，還要快速并且經(jīng)濟(jì)。相比于擴(kuò)增子捕獲法，雜交捕獲的實(shí)驗(yàn)過(guò)程過(guò)于復(fù)雜繁瑣，且手動(dòng)操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，過(guò)多的人工干預(yù)流程可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成不可控的影響，這對(duì)于臨床而言是非常致命的。同時(shí)，擴(kuò)增子捕獲技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程的簡(jiǎn)化極大的降低了操作人員的專(zhuān)業(yè)門(mén)檻，使更多的人能夠完成實(shí)驗(yàn)，徹底解放了人手不足的風(fēng)險(xiǎn)。

擴(kuò)增子捕獲測(cè)序作為全基因組測(cè)序的補(bǔ)充技術(shù)是非常有用的，它大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程和分析目標(biāo)。該技術(shù)已被證明是一個(gè)快速、有效的技術(shù)，并在新一代高通量測(cè)序中發(fā)揮獨(dú)特之處，已經(jīng)產(chǎn)生了許多令人興奮的新發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用領(lǐng)域也越來(lái)越廣泛。

獨(dú)創(chuàng)一步法擴(kuò)增子建庫(kù)技術(shù)重塑NGS技術(shù)屬性

奇輝生物深耕靶向測(cè)序多年，通過(guò)獨(dú)創(chuàng)引物設(shè)計(jì)修飾技術(shù)將擴(kuò)增子捕獲技術(shù)與文庫(kù)構(gòu)建結(jié)合成一步反應(yīng)，成功開(kāi)發(fā)出EMS-Lib™一步法建庫(kù)技術(shù)，該技術(shù)均一性好，擴(kuò)增子拷貝數(shù)變化在1個(gè)log以?xún)?nèi)，有效避免過(guò)度測(cè)序；特異性高，測(cè)序有效分析數(shù)據(jù)高達(dá)99%;操作便捷，單管反應(yīng)，從捕獲到建庫(kù)，手工操作僅10 min。目前以EMS-Lib™一步法建庫(kù)技術(shù)為基礎(chǔ)，已開(kāi)發(fā)出了以下Panel：