維真穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建流程
穩(wěn)轉(zhuǎn)株即穩(wěn)定表達細胞株，指的是基于某一細胞系構(gòu)建的持續(xù)過表達或干擾某特定基因的細胞系。慢病毒感染-藥物篩選法是目前廣泛應(yīng)用的穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建方法，具有高效整合、目標(biāo)細胞廣泛等特點。
一．準(zhǔn)備及預(yù)實驗
- 確定細胞系相關(guān)信息，需包括如下內(nèi)容
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目標(biāo)細胞系培養(yǎng)條件 |
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目標(biāo)細胞增殖速度 |
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支原體污染情況 |
注：為避免慢病毒感染后細胞死亡，務(wù)必保證細胞無支原體污染！
- 預(yù)實驗確定MOI值
- 查閱文獻確定慢病毒在目標(biāo)細胞系中的MOI；
- 參考查閱得到的數(shù)據(jù)，設(shè)計梯度實驗，摸索最適MOI。
- 預(yù)實驗確定篩選藥物用量：
- 查閱Puromycin/Blastincidin等在目標(biāo)細胞系中穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的致死用量信息；
- 參考查閱得到的數(shù)據(jù)，確定3個藥物濃度梯度（如沒有相關(guān)信息，則需將藥物濃度梯度范圍增大，數(shù)量增多至6個）；
- Day0將細胞鋪于6孔板中，使Day1細胞融合度約90%；
- Day1按（2）中設(shè)置的藥物梯度，加入藥物；
- Day4換液，并重新加入藥物；
- Day7觀察，找到致死率100%的孔，該孔使用的藥物濃度，即為藥物篩選濃度。
附1：經(jīng)驗篩選藥物用量
二．穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選及構(gòu)建
注：以下實驗參數(shù)，按1株穩(wěn)轉(zhuǎn)株為例描述，實驗需考慮有無對照穩(wěn)轉(zhuǎn)株！
- 細胞鋪板：
將細胞接種于6孔板中（4個孔），使次日細胞融合度約70%
- 病毒感染：
根據(jù)預(yù)實驗確定的MOI值，計算慢病毒體積，添加慢病毒（每孔添加ADV-HR 2μL）；
- 換液：
慢病毒感染次日，將細胞進行換液處理；
- 觀察感染效率：
感染后72小時，觀察感染效率，效率最低不應(yīng)低于40%。
- 篩選：
- 多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株：從感染72小時后開始于6孔板中加篩選藥物，每隔2天，重新?lián)Q液加入藥物。藥物篩選需至少持續(xù)14天，直至顯微鏡下觀察熒光細胞比例為100%。
注：第一次加入藥物時在上午進行，4-6小時后觀察細胞狀態(tài)，如細胞死亡過多，需更換新鮮不含藥物的培養(yǎng)基。
附2：多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株
多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株的熒光通常強弱夾雜。
- 單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株：建立在獲得多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株基礎(chǔ)上
- 有限稀釋法：
- 取24個1.5毫升EP管，每管中加入800微升完全培養(yǎng)基；
- 用胰酶將多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株消化（90%融合度，10毫升培養(yǎng)基終止消化），取80微升至第一個EP管中，混合均勻
注：應(yīng)使用1000微升槍尖，混合時不要過度吸打，以免破壞細胞。
- 從第一個EP管中取80微升至第二個EP管中，混合均勻，以此類推。
- 將EP管中的細胞懸液，以每孔100微升，接種于96孔板中；
- 過夜培養(yǎng)后，觀察第12-24列，尋找只含有1個細胞的孔，并做好標(biāo)記；
- 培養(yǎng)3-4周，待標(biāo)記孔中細胞擴增后，消化傳代擴增，即為單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞。
注：培養(yǎng)的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。
- 平板挑取法
- 計數(shù)100個多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞，接種于一個10cm培養(yǎng)盤中；
注：盡量吹打均勻，防止細胞聚團。
- 過夜培養(yǎng)后，觀察并尋找單個細胞的位置，并在盤底做標(biāo)記；
- 培養(yǎng)培養(yǎng)2周；
注：培養(yǎng)的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。
- 待標(biāo)記處的細胞擴增為肉眼可見的白點，在移液器尖端吸取一點胰酶，緩慢滴至細胞處，待細胞消化后，迅速吹打，將消化下的細胞轉(zhuǎn)移至96孔板中，傳代擴增，即為單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞。約需2-3周的時間。
注：每盤選取20個為宜，在消化時，需按照先消化邊緣的，再消化中心的原則，防止克隆之間的相互污染。培養(yǎng)的第一周不要換液，接下來每3-4天換液。
附3：單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株
單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株的熒光強度基本一致。
三、穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建中的常見問題
1.支原體污染問題
由于輕度的支原體污染并不影響細胞的生長和增殖，故被許多實驗室所忽略。但支原體易在病毒感染細胞后爆發(fā)，出現(xiàn)大量細胞碎片，甚至導(dǎo)致細胞死亡，導(dǎo)致穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的失敗。我們建議在穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建之初，務(wù)必排除細胞及培養(yǎng)環(huán)境中的支原體污染。
2. 其他問題
除支原體污染之外，還有以下問題會經(jīng)常出現(xiàn)于穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建中。
