知識(shí)分享：PLM-Puromycin試劑說明書

一、產(chǎn)品概述：

 

產(chǎn)品名稱: PLM-Puromycin 試劑      產(chǎn)品貨號(hào)：FH880802 

規(guī)格：100μl（標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格）          濃度：1ug/ul 

推薦使用濃度：1-10 μg/ml      

有效期至：

 

二、產(chǎn)品原理：

 

PLM-Puromycin試劑是一種由鏈霉菌中獲取的氨基糖苷類抗生素，具有與tRNA分子3’末端類似的結(jié)構(gòu)，可以和核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)合成對(duì)革蘭氏陽性菌產(chǎn)生抑制作用�？捎米骱Y選含該抗生素的基因質(zhì)粒，細(xì)胞株構(gòu)建，也可當(dāng)做抗菌類抗生素使用。

 

三、儲(chǔ) 存：

 

保存條件： -20℃或4℃避光保存，盡量避免反復(fù)凍融。   

運(yùn)輸條件：4℃以下低溫運(yùn)輸

 

四、使用說明：

 

以驗(yàn)證目的質(zhì)粒是否具有Puromycin 抗性為例說明本試劑的應(yīng)用：

 

      1.  轉(zhuǎn)染前一天鋪HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)基為含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基，以6 well plate為例，細(xì)胞數(shù)目約為0.5x10⁶ cells。

 

      2.  在無菌管中加入目的DNA質(zhì)粒（1-2 ug）及無血清的DMEM或者Opti-MEM。

 

3.在無菌管中加入無血清的DMEM或者Opti-MEM及本公司VGF轉(zhuǎn)染試劑4 -10 ug。

 

4.將2和3步中的溶液混合，室溫放置20-30min。

 

5.將4步所得混合液逐滴加入至6 well plate中。

 

6.轉(zhuǎn)染48h后，吸棄完全培養(yǎng)基，加入終濃度為1-10 ug/mlPLM-Puromycin試劑的完全培養(yǎng)基2ml。

 

7．再培養(yǎng)48h后，觀察細(xì)胞狀態(tài)，不含嘌呤霉素的細(xì)胞會(huì)飄起死亡，轉(zhuǎn)入含嘌呤霉素抗性質(zhì)粒的細(xì)胞則貼壁生長(zhǎng)。再次吸棄完全培養(yǎng)基，加入終濃度為1-10 ug/mlPLM-Puromycin試劑的完全培養(yǎng)基2ml，繼續(xù)殺死無嘌呤霉素抗性的細(xì)胞。

 

8.再培養(yǎng)48h，若細(xì)胞仍然貼壁生長(zhǎng)且?guī)缀蹰L(zhǎng)滿，結(jié)果說明我們的目的質(zhì)粒含有嘌呤霉素抗性基因，否則目的質(zhì)粒不含嘌呤霉素抗性基因。

 

注意事項(xiàng)：篩選細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞接種密度不能過大，以免影響篩選效率。當(dāng)細(xì)胞密度比較大時(shí)，可加本試劑反復(fù)篩選，直至對(duì)照細(xì)胞完全死亡。建議的一般哺乳動(dòng)物細(xì)胞選用的有效濃度范圍為1-10 μg/ml,使用前要做濃度篩選，選擇最佳濃度。

 

聲明：本試劑僅供于我公司的產(chǎn)品搭配使用，和其他公司產(chǎn)品搭配使用所產(chǎn)生的一切后果均與我公司無關(guān)，本產(chǎn)品的最終解釋權(quán)歸我公司所有。