YIJI細胞蛋白磷酸化酶2A活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
主要用途
YIJI細胞蛋白磷酸化酶2A（PP2A）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用特異性合成底物磷酸化多肽，在PP2A去磷酸化后，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產(chǎn)生鉬藍顯色反應后峰值的變化，采用比色法測定其峰值的變化，以此進行測算單位酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細胞裂解懸液樣品包括免疫沉淀復合物和粗提或部分純化酶樣品的蛋白磷酸化酶2A活性及其抑制劑的檢測。廣泛應用于細胞凋亡、蛋白組學、病理生理學、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應優(yōu)化，檢測敏感。
技術(shù)背景
蛋白磷酸化酶2A（protein phosphatase 2A；PP2A；EC 3.1.3.16），又稱為2型蛋白絲/蘇氨酸磷酸化酶，催化亞體，α異構(gòu)體（type II protein serine/threonine phosphatase catalytic subunit，alpha isoform），是主要的絲/蘇氨酸磷酸化酶成員之一，從酵母到人類高度進化保留。其功能與細胞周期進程、DNA復制和轉(zhuǎn)錄、RNA剪切、轉(zhuǎn)譯等有關。PP2A的結(jié)構(gòu)為異源三體，包括結(jié)構(gòu)亞體、調(diào)節(jié)/目標亞體和催化亞體。PP2A的目標蛋白是腫瘤信號通路的蛋白分子，例如Raf，MEK，Akt等�；谔禺愋缘孜锪姿峄嚯腞KpTIRR，在抑制劑黑海綿酸（okadaic acid）存在與否的情況下，受到蛋白磷酸化酶2A的去磷酸化作用，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產(chǎn)生鉬藍顯色反應后，在分光光度儀下（660nm波長）產(chǎn)生峰值的變化，由此測定黑海綿酸敏感性蛋白磷酸化酶2A（PP2A）的特異活性。
產(chǎn)品內(nèi)容
YIJI清理液（Reagent A） 毫升
YIJI裂解液（Reagent B） 毫升
YIJI緩沖液（Reagent C） 毫升
YIJI陰性液（Reagent D） 毫升
YIJI反應液（Reagent E） 微升
YIJI顯色液（Reagent F） 毫升
YIJI標準液（Reagent G） 微升
YIJI專性液（Reagent H） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存YIJI裂解液（Reagent B）、YIJI緩沖液（Reagent C）、YIJI反應液（Reagent E）、YIJI顯色液（Reagent F）和YIJI專性液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；YIJI顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸； 有效保證6月
用戶自備
15毫升離心管：用于樣品處理的容器
1.5毫升離心管：用于樣品處理和保存的容器
細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離
（微型）臺式離心機：用于樣品收集
培養(yǎng)箱：用于孵育反應物
比色皿：用于比色的容器
分光光度儀：用于比色分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進冰槽里融化。然后進行下列操作。
- 樣品準備
- 準備好25cm2細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（5 X 106細胞）
- 小心加入xx毫升預冷的YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
- 小心抽去清理液
- 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞
- 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞
- 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
- 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
- 小心抽去上清液
- 加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混勻
- 轉(zhuǎn)移到預冷的1.5毫升離心管
- 強力渦旋震蕩15秒
- 置于冰槽里孵育30分鐘
- 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
- 移取2微升進行蛋白定量測定（注意：建議使用YIJI Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YIJI30030.1）
- 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測定準備
- 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）
- 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為660nm，并置零
- 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
- 按下表分別加入YIJI陰性液（Reagent D）和YIJI標準液（Reagent G）到每個離心管，混勻
- 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表
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管號 |
YIJI陰性液（Reagent D） |
YIJI標準液（Reagent G） |
測定體系標準磷濃度 |
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1 |
0 |
xx微升 |
xx微摩爾/升 |
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2 |
xx微升 |
xx微升 |
xx微摩爾/升 |
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3 |
xx微升 |
xx微升 |
xx微摩爾/升 |
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4 |
xx微升 |
xx微升 |
xx微摩爾/升 |
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5 |
xx微升 |
0 |
0 |
- 標準曲線測定
- 移取200微升上述配制的標準液到新的比色皿
- 在30℃溫度下孵育20分鐘
- 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent F），混勻
- 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
- 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
- 重復實驗步驟1至6四次
- 構(gòu)建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標（X軸）為標準磷濃度（微摩爾/升）
- 樣品背景測定
- 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入20微升待測樣品（總量100微克細胞裂解萃取液蛋白）
- 在30℃溫度下孵育20分鐘
- 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent D），混勻
- 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent F），混勻
- 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
- 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
- 根據(jù)標準曲線獲得樣品背景對應磷濃度
- 樣品總活性測定
- 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入20微升待測樣品（總量100微克細胞裂解萃取液蛋白）
- 在30℃溫度下孵育2分鐘
- 加入xx微升YIJI反應液（Reagent E）
- 在30℃溫度下孵育20分鐘
- 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent D），混勻
- 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent F），混勻
- 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
- 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
- 根據(jù)標準曲線獲得樣品總活性對應磷濃度
- 樣品非特異性活性測定
- 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升YIJI專性液（Reagent H）
- 加入20微升待測樣品（總量100微克細胞裂解萃取液蛋白）
- 在30℃溫度下孵育5分鐘
- 加入xx微升YIJI反應液（Reagent E）
- 在30℃溫度下孵育20分鐘
- 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent D），混勻
- 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent F），混勻
- 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照
- 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
- 根據(jù)標準曲線獲得樣品非特異活性對應磷濃度
- 計算樣品活性
- 樣品總活性和非特異活性
- 樣品特異活性計算
注意事項
- 本產(chǎn)品為25次（10個樣本）操作，包括5次（點）標準測定
- 操作時，須戴手套
- 系統(tǒng)操作過程中，標準曲線測定只需1條
- 樣品背景讀數(shù)大于1.0，建議稀釋樣品至0.5-1.0之間
- 如果加樣精準，樣品背景讀數(shù)可以跳過
- YIJI顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸
- 樣品切忌使用磷酸緩沖液、EDTA、EGTA和脫氧膽酸納處理
- 如果使用免疫沉淀復合物作為待測樣品，建議使用YIJI通用型蛋白免疫共沉淀（蛋白A樹脂）試劑盒－YIJI30029.1
- 比色測定后，比色皿須清洗徹底
- 建議使用比色皿測定
- 如果使用96孔板測定，建議反應孵育時，置于平式搖蕩儀搖蕩孵育，速度為50RPM
- 如果用戶沒有660nm波長，可以使用600至660nm的任一波長替代
- 吸光讀數(shù)增高，表明具有酶活性
- 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量； （本公司提供YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YIJI30030.1）
- 蛋白磷酸化酶2A活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 8.0的情況下，每單位酶在單位時間內(nèi)（每分鐘）釋放1微摩爾的磷
- 本公司提供系列蛋白磷酸酶檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準確
