細胞培養(yǎng)生化分析儀選購指南

細胞培養(yǎng)生化分析儀選購指南

單抗類藥物的出現為人類一些自身免疫病、癌癥等疑難病的診斷與治療開辟了廣闊前景，在為人類健康作出突出貢獻的同時也為企業(yè)帶來非常可觀的收入，已成為近年來銷售額最高的一類生物技術藥物。雖然哺乳動物細胞培養(yǎng)技術要求高、抗體表達能力低、生產成本高，但具有其它表達系統(tǒng)無法取代的優(yōu)勢 ：能夠準確的完成糖基化、折疊、鏈內及鏈間二硫鍵的形成等一系列翻譯后修飾，因此其表達的抗體在分子結構、理化特性和生物學功能方面更接近天然產物。自 1996 年以來，FDA批準的生物技術產品中，有 2/3 以上是通過哺乳動

物細胞系統(tǒng)生產的。而中國倉鼠卵巢細胞（CHO）約占哺乳動物細胞表達的90%以上，中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary，CHO）由于具有抗剪切力，易于放大培養(yǎng)的優(yōu)勢，是目前使用最廣泛的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。目前使用最廣泛的 CHO 表達系統(tǒng)是二氫葉酸還原酶（DHFR）和谷氨酰胺合成酶（Glutamineynthetase，GS）表達系統(tǒng)。

近年來關于CHO細胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究越來越多，在很多情況下生物反應器中哺乳動物細胞生產的蛋白質類產品的產量都已達克級有的甚至可達10克級，比80年代中期提高了100多倍，用于治療各種疾病的生物產品的種類也越來越多，這些成果的取得大都依賴于工程宿主細胞的改良，培養(yǎng)基的優(yōu)化以及許多其他工藝流程的創(chuàng)新�；�因組的勘探和細胞工程技術的普遍應用大大方便了科學家對宿主細胞的改造，賦予細胞生長和蛋白產品所期望的特點。

 

一、生化分析儀在細胞培養(yǎng)中的應用

1. 監(jiān)測代謝廢物的積累
       目前公認，在分批培養(yǎng)和大多數流加培養(yǎng)中，乳酸、氨以及其它代謝產物隨著時間的延長在培養(yǎng)基中積累，這些產物抑制了細胞的生長。乳酸一直被認為是在生物反應器中實現高密度細胞濃度的一個障礙，人們一直在為減少乳酸的產生做了各種不懈的努力�？茖W家推測乳酸的積累（即葡萄糖通過糖酵解生成乳酸，而不是進入線粒體完全氧化）一個原因可能是丙酮酸進入線粒體受到了限制，或者TCA循環(huán)和氧化磷酸化發(fā)生了障礙。這一猜測意味著，如果有足夠的碳流量（主要是丙酮酸）進入線粒體產能以及足夠的化學能流出（ATP）到細胞質中，然后以某種方式通過負反饋調節(jié)機制，葡萄糖的過度消耗就會減少，乳酸的產生也隨之降低。一些其他的因素比如高滲透壓以及活性氧的積累都有可能對細胞生長帶來損傷，最終導致細胞活率以及蛋白產量的降低。乳酸和氨的積累對細胞培養(yǎng)的影響比較復雜，對細胞的生長、蛋白產量以及細胞代謝的帶來的變化都有報道。盡管乳酸和氨可能不是培養(yǎng)基中產生的唯一的抑制物，但是它們的積累確實影響了細胞的生長速度，同時乳酸和氨也是灌流培養(yǎng)反應器中需要去除的主要代謝產物。

    CHO轉化細胞無論是在氧氣充足還是氧氣缺乏的時候都傾向通過糖酵解代謝大量的葡萄糖， 這將導致大量的乳酸的產生，這種現象被稱為Warburg 反應。

最近有研究報道對細胞的這種現象做出了解釋，他們認為這是細胞快速的將環(huán)境

中的營養(yǎng)物質轉化為細胞生物量的一個適應過程。然而不同的細胞所耐受的乳

酸濃度也不一樣， 例如當培養(yǎng)基中乳酸濃度高于55mM時，雜交瘤細胞的生長速率降低50%,當乳酸濃度高于60mM時，CHO細胞的生長速率降低25%。

1. 確定流加工藝關鍵控制點

目前上市的重組抗體中絕大多數是采用流加（Fed batch）培養(yǎng)工藝生產，這主要由于與之配套的生物反應器（攪拌罐、氣升罐等）制造成熟，可線形放大（最大至20,000L），操作簡單等原因。但是，流加培養(yǎng)過程中會出現營養(yǎng)物質消耗、代謝廢物積累，以及產品質量不穩(wěn)定等問題。因此需要對流加過程進行監(jiān)控以減少代謝副產物的積累， 使細胞培養(yǎng)時間得以延長，細胞密度以及蛋白類藥物的產量也都能得到增加。

而流加培養(yǎng)中減少代謝物的主要途徑就是通過控制補料方式減少可利用的葡萄糖以及谷氨酰胺使葡萄糖的濃度維持在較低的水平。實驗結果表明，當外部的葡萄糖和氨基酸濃度控制在較低水平時，細胞代謝傾向于向更有效的途徑轉變，過度代謝的流量和代謝物的排泄將大大減弱， 表現為培養(yǎng)基中乳酸的生成大大減少， 細胞代謝從一個高產乳酸的狀態(tài)轉變?yōu)榈彤a乳酸的狀態(tài)。

1. 優(yōu)化培養(yǎng)基配方

動物細胞的體外培養(yǎng)，涉及生物反應器的物理參數（溫度、pH、DO、DCO2等）、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分（葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、維生素等）的消耗，以及自身代謝產物（乳酸、氨、重組蛋白等）的積累與生理生化參數（細胞密度、活性，能荷等）的變化。作為重組抗體生產的“細胞工廠”，上述過程參數的改變會直接影響生產細胞系的活性與重組抗體的收率。比如：當乳酸（58 mM）、滲透壓（382 mOsm/kg）、氨（5.1 mM）參數超過其相應的閾值，細胞活性和抗體產量均會明顯下降[6]。目前，業(yè)內已經對于細胞培養(yǎng)過程參數進行了深入的研究，在動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)中下述參數的控制也已成定式（見下表）。

 

	參數	控制（或測定）范圍	檢測手段	控制策略
營養(yǎng)物質	葡萄糖	0~10g/L	生化分析儀、酶試劑盒	葡萄糖限制性流加
	谷氨酰胺	0~10mM		谷氨酰胺限制性流加
	氨基酸	0~10mM	HPLC	流加濃縮培養(yǎng)基
	核苷酸	0~10mM	HPLC
代謝產物	乳酸	0~50mM	生化分析儀、 酶試劑盒	使用半乳糖替代葡萄糖
	氨	1~10mM		使用丙酮酸、谷氨酸替代谷氨酰胺

流加培養(yǎng)工藝的優(yōu)化主要集中在基礎培養(yǎng)基、流加培養(yǎng)基以及流加策略上，其優(yōu)化的原則是根據細胞的代謝特點設計補料培養(yǎng)基，用于補充易耗成分，降低副產物積累。

• 生化分析儀選購原則

1.生化分析儀的分類

生化分析儀又常被稱為生化儀，是采用光電比色原理來測量體液中某種特定化學成分的儀器。由于其測量速度快、準確性高、消耗試劑量小，現已在各級醫(yī)院、防疫站、計劃生育服務站得到廣泛使用。配合使用可大大提高常規(guī)生化檢驗的效率及收益。

  常見的生化分析儀基于兩種基本原理：第一是酶比色法也就是傳統(tǒng)意義上的生化分析儀，第二是類是隨著生物科技的發(fā)展酶分子改造技術、酶的固定化技術的發(fā)展酶電極法生化分析儀應用而生，主要應用于戰(zhàn)地醫(yī)療、ICU等對檢測速度、檢測環(huán)境又特殊要求的場合。

1.1光學比色生化分析儀發(fā)展歷程

第一代：分光光度計

第二代：半自動生化分析儀：半自動生化分析儀指在分析過程中的部分操作（如加樣、保溫、吸入比色、結果記錄等某一步驟）需手工完成，而另一部分操作則可由儀器自動完成。

第三代：全自動生化分析儀：1957年誕生于美國，全自動生化分析儀，從加樣至出結果的全過程完全由儀器自動完成。操作者只需把樣品放在分析儀的特定位置上，選用程序開動儀器即可等取檢驗報告。按照儀器結構原理可分為 ：連續(xù)流動式（管道式）、分立式、離心式和干片式四類。

1.1.2光學比色生化分析儀檢測過程

（1）檢測原理（針對細胞培養(yǎng)項目）：底物經過一系類的酶的作用生成過氧化氫，過氧化氫與4-氨基安替比林反應生成紅色醌類物質在540nm處有吸收峰。

（2）檢測過程：加樣——加試劑——混合——保溫反應——檢測——輸出結果。

 

1. 酶電極法生化分析儀

2.1 檢測原理：底物經過一系類的酶的作用生成過氧化氫，過氧化氫在電極表面形成電勢差，電勢差的大小與過氧化氫的濃度成正比。

2.1 檢測過程：定標——進樣——酶膜表面反應——檢測——輸出結果

3.生化分析儀檢測速度

由生化分析儀的誕生背景、檢測原理、檢測過程可知，兩種方法的生化分析儀在檢測同一個樣本，同一個項目時間上有很大差異。

	西爾曼科技M900生化分析儀	羅氏cedex bio	Nova bioprofile 400	YSI 2950D	備注
檢測原理	酶膜電極法	酶-光學比色法	酶膜電極法	酶膜電極法
單項目檢測時間（以葡萄糖為例）	45秒	5-10分鐘	45秒	45秒
儀器準備時間（開機自檢、清洗、試劑準備、定標等）	5分鐘	15-20分鐘	5分鐘	5分鐘	正常時間，項目多，定標通不過，有可能準備時間超過30分鐘

1. 單個樣本檢測成本

生化分析儀目前的主流應用在醫(yī)療領域，大型醫(yī)療機構每天有上千個樣本進行檢測，因此生化分析儀的試劑包正常情況下也是500T起，并且每個公司的生化分析儀都會有自己特殊條碼系統(tǒng)，耗材之間不能通用，由于條碼系統(tǒng)的存在，耗材很容易實現壽命控制（試劑包從掃碼之日開始計時，一定時間之后試劑包自動失效，要求客戶重新更換試劑包，否則儀器無法檢測），臨床生化分析儀的盈利模式主要依靠耗材，所以常規(guī)醫(yī)療用生化分析儀不適合細胞培養(yǎng)行業(yè)。

	西爾曼科技M900生化分析儀	羅氏cedex bio	Nova bioprofile 400	YSI 2950D	備注
檢測原理	酶膜電極法	酶-光學比色法	酶膜電極法	酶膜電極法
穩(wěn)定性	cv＜2%	cv＜5%	cv＜2.5%	cv＜2%	穩(wěn)定性
準確性	＜2%	＜2%	＜2%	＜2%	準確性
單項目檢測成本（谷氨酰胺為例）	0.5元	10元左右	10元左右	10元左右	按每天50次檢測量，試劑盒開包后有保質期，檢測樣本越少，單次檢測成本越高

 

1. 日常維護成本

目前無論是細胞行業(yè)還是臨床，生化分析儀即使不用也要進行日常維護，所以作為工業(yè)客戶，本著為公司經濟效益著想，首先要考慮的就是儀器的日常維護的耗材成本、人力資源成本和時間成本。

	西爾曼科技M900生化分析儀	羅氏cedex bio	Nova bioprofile 400	YSI 2950D	備注
生化分析儀光源（燈泡）	——	6000	——	——	按照1000h壽命計算，每天開機10個小時
濾光片	——	4000	——	——	8組濾光片，平均每年更換2片
生化模塊清洗緩沖液	500	2000	15000	5000	按照一年計算
離子模塊清洗液	5000	24000	24000	24000	按照上機壽命30天
氣體模塊清洗液	——		50000	——	按照上機壽命30天
一年維護成本	5500	36000	89000	29000
耗材貨期	一周內	2個月	2個月	2個月

三、總結

生物類似藥因結構極為復雜，研發(fā)壁壘大大高于化學仿制藥，存在研發(fā)周期長、資金投入大、技術要求高的特點。從行業(yè)普遍規(guī)律來看，單抗生物類似藥的研發(fā)大約需要約 5-10 年的時間，研發(fā)費用約 2-3 億美元。但對比生物創(chuàng)新藥，不僅研發(fā)和審批難度大大降低，還可以享受創(chuàng)新藥培育好的市場，對于制藥企業(yè)來說，特別是資金和原創(chuàng)能力不足的企業(yè)，研發(fā)生物類似藥可保證以相對較低的投入獲取相對高的收益。隨著布局生物類似物研發(fā)的企業(yè)逐步增多、融資渠道日益多元，必將會有越來越多的制藥企業(yè)押寶生物類似、蛋白類藥物。

3月20日，在十三屆全國人大一次會議閉幕后，國務院總理李克強在答記者問時表示，我們要較大幅度地降低進口稅率，對抗癌藥品力爭降到零稅率。這對長期依附于進口的蛋白類制藥企業(yè)是個巨大的挑戰(zhàn)，進口藥品勢必大幅降價。因此降低企業(yè)日常運營成本、掌握細胞培養(yǎng)核心技術、提高細胞表達水平是取得最終成功的必由之路！西爾曼科技愿為您的細胞培養(yǎng)優(yōu)化過程提供專業(yè)、可靠的解決方案。