多色流式實(shí)驗(yàn)熒光素的選擇

a. 表中數(shù)值表示各熒光檢測(cè)通道間的顏色補(bǔ)償值(compensation),單位為%。  

b. 以FITC和PE為例：若流式細(xì)胞儀的FL1通道檢測(cè)FITC, FL2通道檢測(cè)PE,則需將儀器的補(bǔ)償設(shè)置為FL1-%FL2=1.10，F(xiàn)L2-%FL1=16.52.具體可理解為PE熒光素的1.10%漏到FL1檢測(cè)通道,需從FL1中減除，而FITC熒光素的16.52%漏到FL2檢測(cè)通道，需從FL2中減除。

2. 常見(jiàn)熒光素?zé)晒鈴?qiáng)度比較

熒光的強(qiáng)度與染色指數(shù)(Stain Index)有關(guān)，染色指數(shù)越高，熒光強(qiáng)度越好；染色指數(shù)較低，染色強(qiáng)度相對(duì)較差。

通過(guò)染色指數(shù)可以看出各個(gè)熒光素的強(qiáng)度：PE>APC>FITC>PerCP

3. 多色流式細(xì)胞檢測(cè)中熒光素選擇的原則

1) 根據(jù)機(jī)器配置選擇熒光素

了解你使用的流式細(xì)胞儀的性能，大多數(shù)流式細(xì)胞儀有兩個(gè)或者多個(gè)激光器，有五種波長(zhǎng)可供選擇：紫外（355 nm）、紫色（405 nm）、藍(lán)色（488 nm）、黃色（561 nm）和紅色（640 nm）。除了激光器，具體的激光片和檢測(cè)器也決定了你的配置可同時(shí)檢測(cè)多少種顏色。

多色標(biāo)記熒光素搭配原則：每個(gè)通道只能選擇一種熒光素；各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配。常用的四色搭配為：FITC, PE, PerCP, APC。

2) 盡量選擇熒光度強(qiáng)的熒光素

FITC、PE、PC-CY5和APC是目前流式細(xì)胞檢測(cè)常用熒光素，基本能滿(mǎn)足日常臨床和科研的需要，盡量選擇熒光強(qiáng)的熒光素。細(xì)胞表面或者內(nèi)部的各種抗原表達(dá)量也不同，如CD4和CD8在細(xì)胞表面的表達(dá)分子數(shù)很多，而CD25等分子在細(xì)胞上的表達(dá)量則不多，在用流式細(xì)胞術(shù)分析這些分子時(shí)應(yīng)根據(jù)表達(dá)量選擇熒光素，對(duì)于表達(dá)量較多的分子，可用FITC等弱熒光素，而對(duì)于表達(dá)量較少的分子，則須針對(duì)您特異的儀器配置，選用熒光較強(qiáng)的熒光素，如PE, PE-CY5或PE-CY5.5等。

3) 保證搭配熒光素的質(zhì)檢發(fā)射光譜重疊度盡量小

當(dāng)兩種熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜重疊時(shí)，可能會(huì)觀(guān)察到一種熒光基團(tuán)滲漏到另一種的檢測(cè)通道（如FITC和PE）。如果不適用熒光補(bǔ)償技術(shù)，就很難分辨不同的群體。最好選擇很少的或者沒(méi)有重疊的熒光基團(tuán)，以最大限度減少這種滲漏。選擇試劑組合時(shí)將光譜疊加可能性降到最低，這可能與選擇最亮的熒光素的規(guī)則是沖突的，如在進(jìn)行四色分析，經(jīng)常會(huì)將PE-Cy5標(biāo)記的抗體與APC標(biāo)記的抗體搭配使用，此搭配需較大幅度地調(diào)節(jié)兩者的顏色補(bǔ)償。可選用PE-Cy5.5來(lái)替代PE-Cy5，顏色補(bǔ)償只需1%左右。因?yàn)镃y5的激發(fā)波長(zhǎng)與APC的激發(fā)波長(zhǎng)相近，所以PE-Cy5熒光素中的Cy5，也會(huì)被激發(fā)APC的第二個(gè)激光器（氦氖激光器）所激發(fā)，導(dǎo)致PE-Cy5與APC的顏色補(bǔ)償很難調(diào)。相反，PE-Cy5.5中的Cy5.5激發(fā)波長(zhǎng)為675nm，不能被激發(fā)APC的第二個(gè)激光器所激發(fā)，也就不存在Cy5.5對(duì)APC的干擾，顏色補(bǔ)償也就很小。因此，可能需要犧牲個(gè)別熒光素的亮度來(lái)避免熒光滲漏以及敏感度喪失。

 要通過(guò)單標(biāo)對(duì)照進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)：

所以盡量選擇光譜重疊度小的熒光素，如FITC/PE-Cy7； 選擇不同激光激發(fā)的熒光素，如FITC/APC, PE/APC。

4) 盡量避免偶聯(lián)熒光染料使用帶來(lái)的假陽(yáng)性

隨著顏色的數(shù)量不斷增加，實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)用到偶聯(lián)熒光染料。偶聯(lián)熒光染料是指兩種熒光素聯(lián)接在一起進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移，如PE-Alexa-Fluor 647或APC-Cy7。但偶聯(lián)熒光染料很容易降解，導(dǎo)致解偶聯(lián)以及兩個(gè)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性，若使用偶聯(lián)的熒光素，務(wù)必要在短時(shí)間內(nèi)盡快完成實(shí)驗(yàn)，曝光時(shí)間越長(zhǎng)，熒光素就越不穩(wěn)定。在固定和透化的過(guò)程中，偶聯(lián)熒光染料的亮度可能降低，因此操作步驟應(yīng)當(dāng)盡可能溫和。補(bǔ)償值可通過(guò)以相同方式處理的樣品來(lái)獲得。