多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM BOT在活細(xì)胞提取中的應(yīng)用
活細(xì)胞提取及應(yīng)用
——單個細(xì)胞級別的活細(xì)胞提取
由于細(xì)胞異質(zhì)性的存在，單細(xì)胞層面的分析就變得十分重要。目前對于單細(xì)胞分析的方法主要還是通過化學(xué)、生物學(xué)的方法進(jìn)行裂解后，提取內(nèi)容物進(jìn)行分析，然而這種方法往往會對樣本造成一些損傷。直接提取活細(xì)胞具有諸多優(yōu)點，但是操作苦難。如今一種全新使用FluidFM 科技的技術(shù)新報道有望提供一種活細(xì)胞提取新型的簡易方法。
1.為什么要進(jìn)行活體單細(xì)胞提取
隨著技術(shù)的發(fā)展，對于細(xì)胞的研究開始向單細(xì)胞領(lǐng)域的分析靠攏。隨著細(xì)胞異質(zhì)性的發(fā)現(xiàn)以來，人們開始更多地認(rèn)識到即使基因型完全相同，但由于基因表達(dá)的不同，也會導(dǎo)致細(xì)胞的表型出現(xiàn)差異，從而使得每個細(xì)胞的功能、組成等各方面也不完全相同。而這種差異是在生物界廣泛存在的，即使同源細(xì)胞群中也是存在的。因此對于單細(xì)胞層面的分子分析，成為了揭示病理特征，細(xì)胞應(yīng)激等方面的重要手段。
隨著技術(shù)的發(fā)展，對于細(xì)胞的研究開始向單細(xì)胞領(lǐng)域的分析靠攏。隨著細(xì)胞異質(zhì)性的發(fā)現(xiàn)以來，人們開始更多地認(rèn)識到即使基因型完全相同，但由于基因表達(dá)的不同，也會導(dǎo)致細(xì)胞的表型出現(xiàn)差異，從而使得每個細(xì)胞的功能、組成等各方面也不完全相同。而這種差異是在生物界廣泛存在的，即使同源細(xì)胞群中也是存在的。因此對于單細(xì)胞層面的分子分析，成為了揭示病理特征，細(xì)胞應(yīng)激等方面的重要手段。
在目前的單細(xì)胞分析手段中也面臨著諸多挑戰(zhàn)。目前主要的方法是使用流式細(xì)胞儀或者微流控芯片對細(xì)胞進(jìn)行分選并隔離單細(xì)胞，然后通過裂解的方式對細(xì)胞進(jìn)行分析。這種高通量分選的方式雖然快速，但是本身需要將細(xì)胞從原始的培養(yǎng)環(huán)境中取出，這樣始終會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部一些生物信息的丟失或損傷。而且由于細(xì)胞破壞方式使用的是化學(xué)或者生物手段裂解，所使用的裂解液也會對細(xì)胞之中的一些組分產(chǎn)生破壞。因此單細(xì)胞分析始終面臨著重大的挑戰(zhàn)。
因此，學(xué)者開始嘗試從活細(xì)胞中直接提取其成分。目前已經(jīng)有諸多不同的活細(xì)胞提取技術(shù)得到了建立，并且通過這類的方法所提取分析內(nèi)容的方法所獲得的結(jié)果往往要好于裂解的方式。因此活細(xì)胞提取技術(shù)是一種更加無損的獲得細(xì)胞內(nèi)組分的方式。
因此，學(xué)者開始嘗試從活細(xì)胞中直接提取其成分。目前已經(jīng)有諸多不同的活細(xì)胞提取技術(shù)得到了建立，并且通過這類的方法所提取分析內(nèi)容的方法所獲得的結(jié)果往往要好于裂解的方式。因此活細(xì)胞提取技術(shù)是一種更加無損的獲得細(xì)胞內(nèi)組分的方式。
2.使用FluidFM 設(shè)備提取細(xì)胞并不會影響細(xì)胞活力
在本文中，作者對首先建立了一種使用FluidFM 提取細(xì)胞的方法。他們嘗試了各種提取量以確定使用FluidFM 能夠?qū)?xì)胞提取的最大量。在實驗中他們發(fā)現(xiàn)使用FluidFM 抽取4 pL的細(xì)胞質(zhì)并觀測，發(fā)現(xiàn)82%的細(xì)胞依然存活，如圖1B 所示。但是如果將抽取量加大到4.5 pL則無細(xì)胞能夠存活。而對細(xì)胞核而言抽取0.6 pL 后，有86%的細(xì)胞依舊存活，如圖1A。而在0.7 pL 或以上的體積提取則不可避免的導(dǎo)致細(xì)胞死亡，如圖1B 所示。隨后他們對提取后細(xì)胞的存活狀況進(jìn)行了考察。而后他們繼續(xù)對提取過的細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞的功能并沒有受到影響。細(xì)胞能夠在提取后約30 小時后正常分裂，如圖1E 所示。因此作者認(rèn)為使用FluidFM 提取的最大量為細(xì)胞核0.6 pL 和細(xì)胞質(zhì)4pL。
在本文中，作者對首先建立了一種使用FluidFM 提取細(xì)胞的方法。他們嘗試了各種提取量以確定使用FluidFM 能夠?qū)?xì)胞提取的最大量。在實驗中他們發(fā)現(xiàn)使用FluidFM 抽取4 pL的細(xì)胞質(zhì)并觀測，發(fā)現(xiàn)82%的細(xì)胞依然存活，如圖1B 所示。但是如果將抽取量加大到4.5 pL則無細(xì)胞能夠存活。而對細(xì)胞核而言抽取0.6 pL 后，有86%的細(xì)胞依舊存活，如圖1A。而在0.7 pL 或以上的體積提取則不可避免的導(dǎo)致細(xì)胞死亡，如圖1B 所示。隨后他們對提取后細(xì)胞的存活狀況進(jìn)行了考察。而后他們繼續(xù)對提取過的細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞的功能并沒有受到影響。細(xì)胞能夠在提取后約30 小時后正常分裂，如圖1E 所示。因此作者認(rèn)為使用FluidFM 提取的最大量為細(xì)胞核0.6 pL 和細(xì)胞質(zhì)4pL。
圖1：細(xì)胞存活率檢測 A)原生細(xì)胞的體積分布圖，虛線為平均值，點線為最大值和最小值；B)細(xì)胞提取體積與活細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系。C)活細(xì)胞細(xì)胞核提取后GFP 的變化；D)死細(xì)胞細(xì)胞核提取后GFP 的變化；E)活細(xì)胞提取后（2.9 pL）后對細(xì)胞形態(tài)的連續(xù)觀測。
3.使用FluidFM 單細(xì)胞提取物的三種應(yīng)用
3.1 透射電鏡負(fù)染色觀測
對于細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的觀察，往往對于揭示細(xì)胞病變有著重要的意義。然而細(xì)胞裂解的傳統(tǒng)手段往往會產(chǎn)生大量的碎片，因此對細(xì)胞器的觀察造成了諸多困難。在本篇報道中，作者通過使用FluidFM 設(shè)備提取細(xì)胞內(nèi)容物，在低溫環(huán)境下轉(zhuǎn)移到透射電鏡的銅網(wǎng)上，然后進(jìn)行負(fù)染色和揮干，之后將片子放到透射電鏡下觀察，并使用傳統(tǒng)裂解方法得到單細(xì)胞溶液同時鋪設(shè)在銅網(wǎng)上進(jìn)行對比。通過觀察他們發(fā)現(xiàn)，使用FluidFM 技術(shù)得到的細(xì)胞提取物能夠觀察到大泡狀的結(jié)構(gòu)、小球狀的結(jié)構(gòu)和長絲類的結(jié)構(gòu)，如圖2C 所示。而相比之下細(xì)胞裂解法得到的結(jié)果卻不盡人意，如圖2D 所示。
3.1 透射電鏡負(fù)染色觀測
對于細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的觀察，往往對于揭示細(xì)胞病變有著重要的意義。然而細(xì)胞裂解的傳統(tǒng)手段往往會產(chǎn)生大量的碎片，因此對細(xì)胞器的觀察造成了諸多困難。在本篇報道中，作者通過使用FluidFM 設(shè)備提取細(xì)胞內(nèi)容物，在低溫環(huán)境下轉(zhuǎn)移到透射電鏡的銅網(wǎng)上，然后進(jìn)行負(fù)染色和揮干，之后將片子放到透射電鏡下觀察，并使用傳統(tǒng)裂解方法得到單細(xì)胞溶液同時鋪設(shè)在銅網(wǎng)上進(jìn)行對比。通過觀察他們發(fā)現(xiàn)，使用FluidFM 技術(shù)得到的細(xì)胞提取物能夠觀察到大泡狀的結(jié)構(gòu)、小球狀的結(jié)構(gòu)和長絲類的結(jié)構(gòu)，如圖2C 所示。而相比之下細(xì)胞裂解法得到的結(jié)果卻不盡人意，如圖2D 所示。
圖2：細(xì)胞提取物負(fù)染色電鏡圖 A)電鏡樣本制作的示意圖；B)提取液滴在電鏡銅網(wǎng)上的放大圖；C)FluidFM 技術(shù)的細(xì)胞提取物電鏡下的圖像；D)普通裂解法的細(xì)胞提取物電鏡下的圖像。
3.2 酶活力的檢測
酶活力的檢測對于探尋細(xì)胞異質(zhì)性有著十分重要的意義。因此作者也對FluidFM 提取的細(xì)胞提取物進(jìn)行了對比。首先作者通過β-半乳糖苷酶實驗來測定提取蛋白的完整性。通過測定酶解底物產(chǎn)生的熒光素的熒光強(qiáng)度，他們成功觀察到熒光強(qiáng)度隨時間而增加，說明提取物中的蛋白沒有被破壞，如圖3C、D 所示。隨后作者又對不同細(xì)胞進(jìn)行了不同酶活力的檢驗，結(jié)果顯示無論是LacZ 轉(zhuǎn)基因HeLa 細(xì)胞上還是在測定HeLa 細(xì)胞的Caspase3 酶上均取得了成功，如圖3 E、F 所示。
酶活力的檢測對于探尋細(xì)胞異質(zhì)性有著十分重要的意義。因此作者也對FluidFM 提取的細(xì)胞提取物進(jìn)行了對比。首先作者通過β-半乳糖苷酶實驗來測定提取蛋白的完整性。通過測定酶解底物產(chǎn)生的熒光素的熒光強(qiáng)度，他們成功觀察到熒光強(qiáng)度隨時間而增加，說明提取物中的蛋白沒有被破壞，如圖3C、D 所示。隨后作者又對不同細(xì)胞進(jìn)行了不同酶活力的檢驗，結(jié)果顯示無論是LacZ 轉(zhuǎn)基因HeLa 細(xì)胞上還是在測定HeLa 細(xì)胞的Caspase3 酶上均取得了成功，如圖3 E、F 所示。
圖3：酶活性分析 A)細(xì)胞提取分析的示意圖；B)將提取的3 pL 細(xì)胞提取物放到預(yù)先液封的微孔中；C)酶解底物產(chǎn)生熒光素的熒光強(qiáng)度變化，熒光在1 小時后可見。D)圖形量化熒光強(qiáng)度時間表；E)LacZ 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞之間β-半乳糖苷酶活性的差異；F）Caspase3 酶活力測定。
4.3 單細(xì)胞級轉(zhuǎn)錄檢測
單細(xì)胞層面的基因表達(dá)通常需要反轉(zhuǎn)錄或者PCR 擴(kuò)增，之后使用qPCR 測定。而在此之前往往需要將細(xì)胞裂解，而作者他們采用了與傳統(tǒng)方法不同的策略。他們首先創(chuàng)建了使用FluidFM 直接從活細(xì)胞中提取大約0.01 pg RNA，并用普通PCR 管合成cDNA 并進(jìn)行qPCR 檢測，如圖4A 所示。由于如此小的提取量是不能直接放到PCR 管里面的，所以他們采取的策略是首先將提取液注入1uL 水中，然后再轉(zhuǎn)移到PCR 管中，進(jìn)行合成和檢測如圖6B 所示。他們檢測了兩種管家基因beta-actin (ACTB)beta-2-microglobulin (B2M)以及GFP mRNA 的表達(dá)量。在21 個樣本中有90%的樣本成功檢測到至少1 中基因的表達(dá)，其中2/3 的樣本可以同時檢測到三種基因的表達(dá)。而對細(xì)胞核的檢測中，也能夠檢測到至少一種基因的表達(dá)，如圖4C 所示。在對比同一細(xì)胞同時提取細(xì)胞質(zhì)（1.7 pL）和細(xì)胞核（1.3 pL）中這三種基因的表達(dá)時，可以發(fā)現(xiàn)兩者基本相同，如圖4D 所示。
單細(xì)胞層面的基因表達(dá)通常需要反轉(zhuǎn)錄或者PCR 擴(kuò)增，之后使用qPCR 測定。而在此之前往往需要將細(xì)胞裂解，而作者他們采用了與傳統(tǒng)方法不同的策略。他們首先創(chuàng)建了使用FluidFM 直接從活細(xì)胞中提取大約0.01 pg RNA，并用普通PCR 管合成cDNA 并進(jìn)行qPCR 檢測，如圖4A 所示。由于如此小的提取量是不能直接放到PCR 管里面的，所以他們采取的策略是首先將提取液注入1uL 水中，然后再轉(zhuǎn)移到PCR 管中，進(jìn)行合成和檢測如圖6B 所示。他們檢測了兩種管家基因beta-actin (ACTB)beta-2-microglobulin (B2M)以及GFP mRNA 的表達(dá)量。在21 個樣本中有90%的樣本成功檢測到至少1 中基因的表達(dá)，其中2/3 的樣本可以同時檢測到三種基因的表達(dá)。而對細(xì)胞核的檢測中，也能夠檢測到至少一種基因的表達(dá)，如圖4C 所示。在對比同一細(xì)胞同時提取細(xì)胞質(zhì)（1.7 pL）和細(xì)胞核（1.3 pL）中這三種基因的表達(dá)時，可以發(fā)現(xiàn)兩者基本相同，如圖4D 所示。
圖4： A)單細(xì)胞提取mRNA 轉(zhuǎn)錄實驗的示意圖；B)將提取物放入液滴中的方法；C) ERCC spike 為對照，測定細(xì)胞質(zhì)中GFP、B2M、ACTB 的Ct 值；D)對同一細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核進(jìn)行提取并測定Ct 值。
總結(jié)
隨著生物研究越發(fā)趨于微觀化，對于分析單個細(xì)胞的需求變得越來越大。但是由于單個細(xì)胞體積小，所能夠提取出的物質(zhì)相比以前細(xì)胞群落分析來說，難度顯著提高。這不僅對檢測儀器的靈敏度有了新的更高的要求，也同時對樣本本身的質(zhì)量也提出了更高的指標(biāo)。本篇中使用FluidFM 提取活細(xì)胞所取得的樣本質(zhì)量相比于傳統(tǒng)裂解手段有了明顯的提高，從而取得了令人滿意的結(jié)果。另外這種方法控制提取量后，甚至能夠做到不殺死細(xì)胞的情況下完成提取，這使得對于對單個細(xì)胞代謝測定的追蹤成為了可能。
隨著生物研究越發(fā)趨于微觀化，對于分析單個細(xì)胞的需求變得越來越大。但是由于單個細(xì)胞體積小，所能夠提取出的物質(zhì)相比以前細(xì)胞群落分析來說，難度顯著提高。這不僅對檢測儀器的靈敏度有了新的更高的要求，也同時對樣本本身的質(zhì)量也提出了更高的指標(biāo)。本篇中使用FluidFM 提取活細(xì)胞所取得的樣本質(zhì)量相比于傳統(tǒng)裂解手段有了明顯的提高，從而取得了令人滿意的結(jié)果。另外這種方法控制提取量后，甚至能夠做到不殺死細(xì)胞的情況下完成提取，這使得對于對單個細(xì)胞代謝測定的追蹤成為了可能。
多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)
瑞士 Cytosurge FluidFM BOT
瑞士 Cytosurge FluidFM BOT
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產(chǎn)品簡介：
多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)--FluidFM BOT，是將原子力系統(tǒng)、微流控系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)為一體的單細(xì)胞操作系統(tǒng)。主要功能包括單細(xì)胞注射、單細(xì)胞提取以及單細(xì)胞分離。
FluidFM BOT 極大的方便了單細(xì)胞水平的研究，尤其適合應(yīng)用于精準(zhǔn)醫(yī)療、單細(xì)胞生物學(xué)、單細(xì)胞質(zhì)譜、單細(xì)胞基因編輯、藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
注射、提取、分選
一體化的單細(xì)胞操縱解決方案 |
參考文獻(xiàn)
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