生物鐘不停歇：通過(guò)研究斑馬魚(yú)來(lái)揭示視網(wǎng)膜生物鐘活性

晝夜節(jié)律和視網(wǎng)膜生物鐘
人類(lèi)以及許多其他動(dòng)物體，睡眠-清醒循環(huán)以及其他的生物節(jié)律過(guò)程是由內(nèi)源性振蕩器-生物鐘所調(diào)節(jié)的。生物鐘受一系列基因控制，這些基因的表達(dá)因是否有光照所微調(diào)，從而使得每日的生物節(jié)律適應(yīng)于日夜循環(huán)交替。
 
在哺乳動(dòng)物的大腦中，生物鐘母鐘（主要的控制因子）位于下丘腦視交叉上核。然而它并非每日節(jié)律的單一控制因子。體內(nèi)還有其他的一些節(jié)律振蕩器，比如視網(wǎng)膜生物鐘，調(diào)節(jié)神經(jīng)視網(wǎng)膜的很多生理活動(dòng)。
 
斑馬魚(yú)的視網(wǎng)膜生物鐘
盡管普遍認(rèn)為視網(wǎng)膜生物鐘響應(yīng)外部光線強(qiáng)弱調(diào)節(jié)視覺(jué)靈敏度，但對(duì)其明確的機(jī)理和基因作用了解甚少。斑馬魚(yú)的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)以及功能和哺乳動(dòng)物包括人類(lèi)近似，這是將斑馬魚(yú)作為視網(wǎng)膜生物鐘實(shí)驗(yàn)研究模型的重要優(yōu)勢(shì)。因此斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜節(jié)律基因的研究對(duì)于人類(lèi)視網(wǎng)膜生物鐘的認(rèn)識(shí)可能具有重要意義。

值得提及的是，合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室和中國(guó)科學(xué)院腦功能與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的黃姓研究員等人最近研究了斑馬魚(yú)的Per 2基因。 Per 2基因被認(rèn)為對(duì)視網(wǎng)膜生物鐘機(jī)制具有重要作用。 這個(gè)基因片段是光調(diào)節(jié)基因，在持續(xù)的無(wú)光條件下，Per 2基因的表達(dá)會(huì)被極大抑制。
 

_{斑馬魚(yú)的視網(wǎng)膜}

創(chuàng)造斑馬魚(yú)的基因突變體來(lái)研究視網(wǎng)膜生物鐘
研究某指定基因片段的功能通常是創(chuàng)造一個(gè)缺失該基因的表型來(lái)和自然存在的最普遍的野生表型對(duì)比。黃姓研究員等人就是采用了該方法。他們制作了缺失Per 2基因的斑馬魚(yú)幼體，進(jìn)行了各種解剖學(xué)，分子生物學(xué)以及行為表現(xiàn)研究來(lái)比對(duì)突變表型和野生表型。
 
斑馬魚(yú)的Visiobox和Zebrabox的測(cè)試
黃姓研究員等人做的行為分析的其中一項(xiàng)是視動(dòng)力反應(yīng)測(cè)試(OKR)。測(cè)試分析可以反映視力和對(duì)比敏感度。在這項(xiàng)測(cè)試中，斑馬魚(yú)幼體被固定在下面有紅外線光源的培養(yǎng)皿里。光源在幼體周?chē)�發(fā)射出旋轉(zhuǎn)光柵。光柵引起眼球運(yùn)動(dòng)，會(huì)被紅外敏感CCD鏡頭實(shí)時(shí)捕捉。在不同的空間頻率（0.02, 0.04, 0.06, 0.08周/度）條件下測(cè)試視力情況。對(duì)比敏感度用‘Gain’值（增益）也就是眼球運(yùn)動(dòng)速度與刺激條紋速度的比值來(lái)衡量。此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目更好的選擇是采用Viewpoint公司所研發(fā)的Visiobox產(chǎn)品，該產(chǎn)品致力于改善實(shí)驗(yàn)的精確度，分析方法以及再現(xiàn)性。其都將歸功于Visiobox強(qiáng)大的自動(dòng)觀測(cè)和跟蹤斑馬魚(yú)幼體的視覺(jué)行為的功能。

   
_{VisioBox系統(tǒng)影像輸出斑馬魚(yú)的視動(dòng)反應(yīng)測(cè)試（OKR）}

黃姓研究員團(tuán)隊(duì)也進(jìn)行了斑馬魚(yú)幼體的視覺(jué)運(yùn)動(dòng)反應(yīng)（VMR）的實(shí)驗(yàn)研究。該研究是使用ZebraBox系統(tǒng)進(jìn)行的。ZebraBox可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)觀測(cè)和跟蹤斑馬魚(yú)幼體，同時(shí)研究數(shù)量可多達(dá)96條。采用這個(gè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)條件的全方位控制。斑馬魚(yú)幼體（突變表型和野生表型）被分別放置在96個(gè)孔板里。在正式實(shí)驗(yàn)之前，這些幼體被置于ZebraBox系統(tǒng)提供的完全無(wú)光條件下3.5小時(shí)以適應(yīng)該條件。之后突然瞬間調(diào)整光照條件。幼體的每一秒的動(dòng)作都被系統(tǒng)一幀幀記錄下來(lái)。對(duì)斑馬魚(yú)幼體樣品的其他測(cè)試包括免疫組織化學(xué)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，電鏡成像等，這樣可以觀測(cè)視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)成分和基因表達(dá)。
 
_{斑馬魚(yú)仔魚(yú)行為觀察箱(ZebraBox)}

數(shù)據(jù)分析
在對(duì)行為數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析之后，黃姓研究員等人確定了缺乏per 2基因片段的個(gè)體會(huì)在白天表現(xiàn)出對(duì)比敏感度減弱的跡象以及視力低下。但即使缺乏per 2基因片段仍然具備視動(dòng)力反應(yīng)晝夜節(jié)律。

針對(duì)Per 2基因突變體在light-on模式（光電傳感器動(dòng)作模式）視覺(jué)運(yùn)動(dòng)反應(yīng)表現(xiàn)出缺陷的情況，他們決定對(duì)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究，他們認(rèn)為視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的變化可能是引起視力減弱的原因。通常認(rèn)為視網(wǎng)膜異常的突觸帶可能導(dǎo)致了視力低下，因此他們進(jìn)行了解剖學(xué)和分子生物學(xué)研究。果然，黃姓研究員團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在突變體中，突觸帶和突觸后進(jìn)程沒(méi)有聯(lián)系，甚至和拱形致密區(qū)以及突觸前膜沒(méi)有關(guān)聯(lián)。他們推斷per 2基因?qū)τ阱F形視蛋白的表達(dá)有重要作用，因此導(dǎo)致了視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化。
 
數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化結(jié)論
根據(jù)上面提及到的，研究證明時(shí)鐘基因?qū)σ暰W(wǎng)膜形成視覺(jué)的功能很重要。缺失per 2基因的斑馬魚(yú)突變體表現(xiàn)出對(duì)比敏感度和視力低下的情況。尤其缺失per 2基因的斑馬魚(yú)在白天的的視動(dòng)力反應(yīng)測(cè)試的gain值降低。然而，它們即使缺乏per 2基因片段仍然具備視動(dòng)力反應(yīng)晝夜節(jié)律。這有可能是因?yàn)閜er 2基因片段對(duì)于分子鐘或者行為節(jié)律影響不大。另外，per 2突變體表現(xiàn)出視網(wǎng)膜突觸帶異常和數(shù)量減少的現(xiàn)象，這可能是導(dǎo)致視力低下的原因。
 
該研究的未來(lái)展望
綜上所述，per 2基因突變的斑馬魚(yú)盡管在視網(wǎng)膜中時(shí)鐘基因的節(jié)律表現(xiàn)正常，但因異常的突觸帶而變現(xiàn)出來(lái)視力低下的情況。從數(shù)據(jù)來(lái)看，時(shí)鐘基因影響了視覺(jué)功能，是因?yàn)樽璧K了神經(jīng)發(fā)育而并非是晝夜節(jié)律失調(diào)。研究闡述了per 2基因在調(diào)節(jié)視覺(jué)過(guò)程中的主要作用機(jī)制。為未來(lái)視網(wǎng)膜生物鐘控制的準(zhǔn)確遺傳學(xué)機(jī)理研究以及將經(jīng)驗(yàn)類(lèi)推到哺乳動(dòng)物甚至人類(lèi)身上開(kāi)辟了新的思路。
 
參考文獻(xiàn)
Huang D, Wang M, Yin W, Ma Y, Wang H, Xue T, Ren D and Hu B. (2018). Zebrafish Lacking Circadian Gene per2 Exhibit Visual Function Deficiency. Front. Behav. Neurosci. 12:53. doi: 10.3389/fnbeh.2018.00053