皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)的介紹及應(yīng)用

腫瘤細(xì)胞系移植模型（CDTX）因易構(gòu)建、成瘤率高、周期短等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用，并且目前臨床上常用的抗腫瘤藥大多是通過(guò)該模型而被發(fā)現(xiàn)。本期咱們就首先為大家介紹，CDTX模型中看似最簡(jiǎn)單卻深藏多種不確定因素的皮下荷瘤。

皮下荷瘤定義
腫瘤細(xì)胞系移植到同種或異種動(dòng)物的皮下形成腫瘤塊，荷瘤是將腫瘤細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)的專業(yè)說(shuō)法，皮下荷瘤屬于腫瘤細(xì)胞系移植模型（CDTX），CDTX還包括各種轉(zhuǎn)移模型荷瘤、原位荷瘤等。

皮下荷瘤應(yīng)用
一般用于抑制腫瘤生長(zhǎng)（細(xì)胞增殖）的藥物的篩選檢測(cè)。如果單獨(dú)研究腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，那么幾乎所有的腫瘤均可通過(guò)皮下荷瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

第一部分：皮下荷瘤模型的幾個(gè)考慮因素
（1）腫瘤細(xì)胞系的選擇
腫瘤細(xì)胞株的選擇，是一個(gè)很麻煩的問(wèn)題，卻是最重要的問(wèn)題。有以下幾點(diǎn)要求：
① 不同腫瘤細(xì)胞系的成瘤率不同，需選取成瘤率高的細(xì)胞系；如乳腺癌細(xì)胞MCF-7，雖在體外應(yīng)用多，但體內(nèi)成瘤率差，生長(zhǎng)慢，因此一般不選用；
② 腫瘤細(xì)胞根據(jù)分子標(biāo)記分為多種，考慮成瘤率外，選擇時(shí)還需考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，如針�?duì)藥物靶點(diǎn)HER2，需要選擇HER2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞如SKBR-3，而不是HER2陰性的MDA-MB-231；再如研究靶向kras突變腫瘤的藥物，我們選取kras突變的（其突變類型又屬于突變率比較高的），又易培養(yǎng)且成瘤率好的A549。
③ 實(shí)驗(yàn)用腫瘤細(xì)胞株多為人源或鼠源細(xì)胞系，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇，一般鼠源細(xì)胞系更易荷瘤，但是人源細(xì)胞系會(huì)更貼近人類腫瘤生長(zhǎng)情況。
（2）小鼠品系的選擇
由于腫瘤細(xì)胞系主要分為人源和鼠源，因此小鼠品系的選擇要根據(jù)細(xì)胞系來(lái)源。
人源細(xì)胞系：為異種移植，應(yīng)該選擇免疫缺陷的小鼠（如：nude，NOD/scid，NSG，詳情點(diǎn)
擊鏈接3.2 免疫缺陷動(dòng)物（一）。
鼠源細(xì)胞系：為同種移植，選擇與腫瘤細(xì)胞系來(lái)源一致的小鼠（C57BL/6品系來(lái)源的黑色素
瘤細(xì)胞系B16F10就要選擇C57BL/6品系的小鼠）。不過(guò)裸鼠或其他免疫缺陷鼠的免疫系統(tǒng)
異常，不適用于篩選免疫調(diào)控藥物。
（3）接種部位
應(yīng)選擇血管豐富且易操作的部位，如腋下、腹股溝、側(cè)腹部及頸背部等部位。其中腋下中部皮下較好，成瘤率高。如下圖所示：

Nude裸鼠腋下處皮下荷瘤（人源乳腺癌細(xì)胞系SKBR-3）

第二部分：裸鼠皮下荷瘤步驟
一般更多的時(shí)候是選擇人源腫瘤細(xì)胞系，然而由于存在免疫排斥，需選擇裸鼠荷瘤。
下面以裸鼠為例，為大家詳細(xì)介紹皮下荷瘤的實(shí)驗(yàn)過(guò)程
⑴ 腫瘤細(xì)胞的傳代擴(kuò)增
取凍存于液氮的腫瘤細(xì)胞復(fù)蘇并擴(kuò)增，確保腫瘤細(xì)胞的活力和良好的生長(zhǎng)狀態(tài)
⑵ 計(jì)算細(xì)胞接種量
根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般鼠源腫瘤細(xì)胞接種2～100萬(wàn)/只，而人源腫瘤細(xì)胞則需要200-1000萬(wàn)/只以
上。當(dāng)然最好結(jié)合文獻(xiàn)來(lái)確定細(xì)胞接種量，在找不到相關(guān)資料的情況下，最高就用到1000
萬(wàn)/0.1ml，不可再高（因?yàn)榧?xì)胞懸液已達(dá)飽和狀態(tài)）。并且提前計(jì)算確定細(xì)胞數(shù)量，一般注射40只小鼠，至少需要準(zhǔn)備50只小鼠的細(xì)胞量。
⑶ 準(zhǔn)備裸鼠
一般選擇5-6W裸鼠，小于4W動(dòng)物可能不耐受而過(guò)早死亡，大于6W免疫力會(huì)增強(qiáng)，不
易成瘤；
每批實(shí)驗(yàn)只用同一性別動(dòng)物，通常雌雄均可，但是根據(jù)研究的腫瘤類型及腫瘤細(xì)胞系選擇（乳
腺癌等要選擇雌性，前列腺癌等要選擇雄性）
⑷ 操作步驟（請(qǐng)觀看視頻）
① 接種時(shí)選擇好部位進(jìn)針，建議接種前酒精棉球擦拭消毒進(jìn)針位置；
② 向前方穿行，注射前針頭稍微動(dòng)一動(dòng)，能動(dòng)說(shuō)明在皮下，否則可能在皮內(nèi)或者肌肉內(nèi)；
③ 針頭在皮下走一段再注射，速度不可太快，一般體積為100-200μL（PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，若不易成瘤可添加matrigel促進(jìn)成瘤），可看見(jiàn)明顯的鼓包；
④ 接種點(diǎn)離進(jìn)針點(diǎn)盡量較遠(yuǎn)，減少漏液和污染的可能；
⑤ 注射完畢后，緩慢退出針頭，盡量避免漏液；
⑥ 細(xì)胞需一直置于冰上，使細(xì)胞處于比較低的代謝狀態(tài)，一般2h之內(nèi)不會(huì)有問(wèn)題。
下面為皮下荷瘤視頻（包括各個(gè)部位的注射手法）：
視頻
第三部分：后續(xù)實(shí)驗(yàn)安排
⑴ 分組：一般來(lái)說(shuō)皮下荷瘤主要用于抗腫瘤藥物的檢測(cè)，因此我們一般分為對(duì)照組，陽(yáng)性藥物組，低劑量、中劑量及高劑量藥物組等；
⑵ 數(shù)量：荷瘤時(shí)每組不少于10只，考慮到小鼠成瘤率和死亡原因，最終實(shí)驗(yàn)應(yīng)至少可以獲取6個(gè)有效數(shù)據(jù)；
⑶ 給藥時(shí)間：一般接種7-10天后便可看到腫瘤長(zhǎng)起，便可分組實(shí)驗(yàn)（鼠源細(xì)胞系會(huì)更快）；
⑷ 人道終點(diǎn)：動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)定，小鼠腫瘤重量不可超過(guò)小鼠體重10%，平均腫瘤直徑
不超過(guò)20mm，并且如果出現(xiàn)潰爛，造成感染或壞死時(shí)，應(yīng)該中止實(shí)驗(yàn)且對(duì)動(dòng)物施行安樂(lè)死。
補(bǔ)充正常免疫小鼠的荷瘤
基本步驟與裸鼠荷瘤一致，只是比較繁瑣的是，由于野生型小鼠有毛發(fā)，所以需要剃毛（如
上圖Balb/c小白鼠腹股溝皮下荷瘤鼠源結(jié)腸癌CT26）
第四部分： 皮下荷瘤的幾點(diǎn)問(wèn)答
⑴ 瘤子長(zhǎng)不出來(lái)是怎么回事？
一方面可能是細(xì)胞狀態(tài)差，活力不好，或是腫瘤細(xì)胞不易成瘤，需加入Matrigel輔助或增大接種量或更換細(xì)胞系；一方面可能是小鼠周齡太大，或小鼠免疫排斥，建議更換免疫缺陷程度更大的小鼠（Nod-scid小鼠，NOG小鼠＞ Nude裸鼠）
⑵ 小鼠瘤子長(zhǎng)起來(lái)又消失？
腫瘤塊先縮小，后變大很常見(jiàn)，很可能是炎癥反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞被小鼠自身吸收，繼續(xù)觀察腫瘤細(xì)胞吸收之后是否經(jīng)過(guò)幾周還能長(zhǎng)出來(lái)，長(zhǎng)不起來(lái)建議換鼠。
⑶ 均一性很差，腫瘤體積差距較大？
如果荷瘤分組發(fā)現(xiàn)小鼠腫瘤體積差距很大，這可能跟小鼠周齡及接種細(xì)胞量不一致導(dǎo)致，建議重新做實(shí)驗(yàn)分組。
⑷ 是否可以在一只小鼠進(jìn)行多個(gè)點(diǎn)荷瘤？
不可以，一只老鼠就只能接種一個(gè)點(diǎn)。因?yàn)橐粋�(gè)老鼠身上有多個(gè)腫瘤塊的情況下，可能會(huì)相互影響。
⑸ 是否應(yīng)用免疫抑制劑加速腫瘤生長(zhǎng)？
如果裸鼠荷瘤不生長(zhǎng)，可以參考文獻(xiàn)，用免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺（抑制裸鼠NK細(xì)胞活性）
促進(jìn)生長(zhǎng)；不過(guò)最好不要為了縮短造模周期來(lái)加速生長(zhǎng)，因?yàn)榭赡軙?huì)造成潰爛，這樣就不得
不中止實(shí)驗(yàn)。所以一般情況下，應(yīng)盡量符合細(xì)胞系本身的生長(zhǎng)特性，不應(yīng)過(guò)多地人為的干擾。

皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)介紹就到此結(jié)束了，原來(lái)看似簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)卻有多種不可忽視的因素需要考慮。
簡(jiǎn)單回顧一下，皮下荷瘤模型中細(xì)胞系和小鼠品系是最需要考慮的兩大因素，切記一定要多
查閱文獻(xiàn)并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而找到最合適的皮下腫瘤模型。