定量western blot疑問解答-為什么需要驗證抗體

驗證抗體對于結(jié)果的一致性和重復(fù)性是至關(guān)重要的，即確認抗體能特異性識別感興趣的蛋白，抗體與其他蛋白的交叉反應(yīng)性情況。在您的論文提交給期刊發(fā)表之前，經(jīng)常需要驗證抗體的特異性，但并非所有人都花時間進行驗證�；蛘吆芏嗳硕颊J為他們使用抗體進行了免疫共沉淀驗證，因而不需要再通過蛋白質(zhì)印跡進行驗證。然而，抗體與抗原的親和性高度依賴于實驗條件，因此，驗證您的試驗方法中的條件適用于抗體與抗原的結(jié)合是十分重要的。
定量western blot尤其適用于確認獲得的信號僅來自感興趣的蛋白。如果沒有進行抗體驗證（并且驗證熒光信號與蛋白質(zhì)的量呈線性關(guān)系），將無法獲得下游定量分析所需的準確度和精確度。
為確保實驗質(zhì)量，國際抗體驗證工作組提供了五種不同的抗體驗證方法，其中四種方法適用于western blot，他們建議至少使用其中兩種方法進行抗體驗證。
 
遺傳策略
盡管這些方法已經(jīng)被更新了，但在科研領(lǐng)域中的生物化學家對他們應(yīng)該都很熟悉。即用CRISPR-Cas9或RNA干擾（RNAi）在實驗組和對照組中進行敲除或敲低實驗，然后使用特異性抗體測定目標蛋白的熒光信號。處理后的目標蛋白質(zhì)的表達很少甚至沒有，所以觀察到的任何信號都表明抗體存在交叉反應(yīng)性。
如左圖所示，將具有特定蛋白質(zhì)的細胞裂解物進行western blot，分別使用兩種不同siRNA分子敲低目的蛋白的表達，如泳道1和泳道2，與泳道C的對照組相比，我們可以看出siRNA脫靶帶來的影響。