抗體純化中的常見問題

1、優(yōu)質(zhì)的抗體包含的條件：
⑴抗體的純度大于95%（這里的純度是指有效抗體的含量而不是單純的電泳純度）；
⑵抗體的活性（效價高）；
⑶抗體的穩(wěn)定性（4保存10天無沉淀，-20保存3年以上效價無明顯變化，反復(fù)凍融10次無沉淀）。
 
2、ProteinA/G純化的不利因素：
Protein A是一種金黃色葡萄球菌（Protein G是一種鏈球菌株）細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，能特異性地與人和哺乳動物抗體（主要是IgG）的Fc區(qū)結(jié)合（有時結(jié)合少許IgM），故此可以分離出IgG抗體。但是Protein A/G卻無法區(qū)分特異性IgG的Fc段還是非特異性IgG的Fc段，故此Protein A/G純化出的是總的IgG蛋白。
 
腹水中含有白蛋白、γ球蛋白、巨球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、細(xì)胞及其殘片、脂肪、小鼠的各種雜蛋白（如游離的鼠IgG、IgM），而我們真正需要的抗體只占很少一部分（大約占15%左右）；而抗血清中的有效抗體也只占總IgG的30%左右，其余都是無關(guān)的IgG或無用的抗體；所以Protein A/G純化的抗體看似“很純”（電泳圖），其實真正有效的“目的抗體”單抗只占比75%左右，（兔）多抗只占比30%左右。
 
3、利用抗原親和純化抗體的優(yōu)缺點。
親和純化是抗體抗原的結(jié)合，理論上應(yīng)該是純度最高特異性最好的純化方法，但是通常由于抗原的提取難度非常困難，所以獲得高純度的抗原并不是一件非常簡單的事情。當(dāng)我們不能獲得高純度的抗原時親和層析做出來的抗體也就不會那么純了；另外親和純化時抗原抗體的結(jié)合比較牢固，要想分離抗原抗體就需要大幅降低洗脫液的pH值，抗體（蛋白）在這么低地pH下很容易變形失活，損傷是無法避免的。故此種情況下純化出的抗體穩(wěn)定性差，4保存1天就會出現(xiàn)少許沉淀，反復(fù)凍融很容易產(chǎn)生沉淀。
 
4、純化出的抗體效價低的原因。
效價低是因為特異性抗體含量少；有沉淀是因為抗體純度不夠，雜蛋白含量高，如果是親和純化的抗體，那么可能是由于純化過程中，抗體受到了損傷，抗體的結(jié)構(gòu)和性能有所改變引起的。
 
5、為什么用Protein A/G純化的抗體電泳很純但做WB時卻并不理想？
聚丙烯酰胺凝膠電泳可用做蛋白質(zhì)純度的鑒定，聚丙烯酰胺凝膠電泳同時具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，可以將分子大小相同而帶不同數(shù)量電荷的物質(zhì)分離開，并且還可以將帶相同數(shù)量電荷而分子大小不同的物質(zhì)分離開。其分辨率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般層析方法和電泳方法，且重復(fù)性好，沒有電滲作用。
 
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可測定蛋白質(zhì)分子量。其原理是：帶大量電荷的SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上克服了蛋白質(zhì)分子原有電荷的影響而得到恒定的荷/質(zhì)比。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測蛋白質(zhì)分子量已經(jīng)比較成功，此法測定時間短，分辨率高，所需樣品量極少（1-100ug），但只適用于球形或基本上呈球形的蛋白質(zhì)，某些蛋白質(zhì)不易與SDS結(jié)合，如木瓜蛋白酶，核糖核酸酶等，此時測定結(jié)果就不準(zhǔn)確。
 
電泳只能根據(jù)分子量的大小進(jìn)行分離，無法區(qū)分蛋白的性質(zhì)，比如IgG的分子量都是150KD，通過電泳時無法區(qū)分哪些是自身的IgG，哪些是抗體的IgG。而Protein A/G純化出的是總的IgG蛋白，分子量都是150KD，故此通過電泳條帶都是一樣的，無法將雜IgG和目的抗體IgG分離出來。所以有時用Protein A/G純化的抗體，電泳很純但做WB時卻并不理想，這是純化方法和純化工藝的不當(dāng)引起的。
 
6、為什么抗體需要純化？
腹水或血清含有大量的雜蛋白和多種抗體，真正需要的抗體正常情況下只占總蛋白的15%左右。未純化的抗體（或純化不好的抗體），不僅會干擾實驗的正常進(jìn)行，而且還可能產(chǎn)生與實驗預(yù)期相反的結(jié)論。
 
抗體純化的好處：純化的抗體能降低非特異性本底，去除引起實驗誤差的污染蛋白，另一方面能精確控制實驗中產(chǎn)生陽性信號的抗體量，可以濃縮抗體。