PCR法在動(dòng)物組織樣品中提取RNA/cDNA和基因組DNA的應(yīng)用

    本實(shí)驗(yàn)樣品來(lái)自于人、狗、貓、老鼠、牛、馬，還有魚和蛤等新鮮動(dòng)物組織樣品，使用高通量組織研磨法處理，經(jīng)Real-Time Taqman PCR方法，提取并檢測(cè)RNA/cDNA和基因組DNA的提取質(zhì)量，最終得出結(jié)論：使用SPEX高通量組織研磨儀研磨動(dòng)物組織，可以快速高通量的完成樣品制備，且核酸提取量高、提取的核酸質(zhì)量好。
 
 
1、樣品采集、制備和組織研磨
    采集新鮮動(dòng)物組織樣本，修剪至約50-100mg濕重，在液氮中快速冷凍，并保存在-80℃低溫冰箱中。樣品來(lái)自于人、狗、貓、老鼠、牛、馬，還有魚和蛤（見表1所示）。在提取DNA或RNA之前，將這些冷凍后的組織，放入深孔板中，并將深孔板放置在干冰上冷凍。每個(gè)孔中放入兩顆4m鋼珠(SPEX貨號(hào)2150) ，再加入500mL緩沖液(應(yīng)用生物系統(tǒng)核酸純化裂解緩沖液)。用深孔板蓋板密封，在高通量組織研磨儀上以每分鐘1000次的速度研磨2min。4℃環(huán)境下培養(yǎng)30min后，用裂解液提取gDNA或總RNA。使用高通量組織研磨儀優(yōu)化后，再使用6700全自動(dòng)核酸工作站進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，最后提取的RNA或DNA的組織量在10到20mg之間。
 
2、采用Real-Time Taqman PCR技術(shù)對(duì)提取的RNA/cDNA和基因組DNA進(jìn)行質(zhì)量控制
    為評(píng)價(jià)提取的RNA的質(zhì)量，采用Invitrogen產(chǎn)品合成互補(bǔ)DNA (cDNA)：200 units of SuperScript III, 600 ng of random hexadeoxyribonucleotide (pd(N)6) primer (random hexameter priner), 10 U RnaseOut (Rnase inhibitor), and 1 mM dNTPs in a final volume of 40 L.
    逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在50℃下進(jìn)行50min，加入60微升水，加熱5min至95℃，在冰上冷卻，終止反應(yīng)。根據(jù)內(nèi)源性對(duì)照TaqMan PCR系統(tǒng)從一定數(shù)量的組織中獲得的CT值判斷cDNA的質(zhì)量。值高于一定閾值的樣品表明樣品質(zhì)量受損，總RNA降解，需要重新提取備用樣品。為了評(píng)估cDNA的質(zhì)量，我們通常使用的TaqMan PCR系統(tǒng)，目標(biāo)是物種特異性的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)或核糖體基因(如18S rRNA或ITS-2)。
    為了評(píng)估提取的基因組DNA的質(zhì)量，開發(fā)了針對(duì)單個(gè)拷貝基因的物種特異性TaqMan PCR系統(tǒng)，以定量基因組當(dāng)量和細(xì)胞數(shù)量。表1概述了用于gDNA質(zhì)量控制的TaqMan系統(tǒng)。使用針對(duì)單個(gè)復(fù)制基因的TaqMan PCR系統(tǒng)，根據(jù)CT值判斷一定數(shù)量組織的gDNA質(zhì)量。值高于某一閾值的樣本表明DNA已經(jīng)降解，需要重新提取備用樣本。GAPDH TaqMan系統(tǒng)可以用來(lái)靶向單拷貝GAPDH偽基因。
    每個(gè)Real-Time TaqMan每個(gè)引物的PCR反應(yīng)包含400nM，80nM的TaqMan探針和市場(chǎng)上買到的PCR試劑(TaqMan一般性PCR試劑：Applied Biosystems)包含10mM Tris-HCl (pH值8.3)，50 mM KCl，MgCl₂ 2.5mM，2.5mM三磷酸脫氧核苷酸，0.625 U AmpliTaq Gold DNA polymerase per reaction, 0.25 U AmpErase UNG per reaction and 5μL of the diluted cDNA sample or the gDNA in a final volume of 25 μL.樣品置于96孔板中，在自動(dòng)熒光儀(ABI PRISM 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)，Applied Biosystems)中擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為50℃時(shí)為2 min, 95℃時(shí)為10 min, 95℃時(shí)為40個(gè)15s，60℃時(shí)為60 s循環(huán)。
 

1. 結(jié)論

    使用SPEX高通量組織研磨儀研磨動(dòng)物組織，可以快速高通量的完成樣品制備，且核酸提取量高、提取的核酸質(zhì)量好。