Small RNA—從功能研究到基因治療

在過(guò)去的十年里，小RNAs（small RNA）已經(jīng)成為基因表達(dá)和基因組功能的重要調(diào)節(jié)因子，幾乎在生物學(xué)的各個(gè)方面都發(fā)揮著作用。許多小RNAs通過(guò)RNA干擾（RNAi）相關(guān)機(jī)制發(fā)揮作用，這些機(jī)制通過(guò)對(duì)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）進(jìn)行編程以識(shí)別和抑制目標(biāo)。還有一類(lèi)天然microRNAs（miRNAs），可在體內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達(dá)程序。miRNA功能的改變是導(dǎo)致人類(lèi)疾病的一個(gè)重要因素，而對(duì)特定miRNA的調(diào)控正成為一種新的治療手段。小RNA的用途遠(yuǎn)不止如此，快來(lái)跟小編一起深入了解small RNA—從功能研究到基因治療。

（1）小RNA 起源
目前，我們對(duì)于通過(guò)RISC發(fā)揮作用的小RNAs的發(fā)生，認(rèn)識(shí)比較全面。在動(dòng)物中，這種小RNAs主要有三類(lèi)：小干擾RNA（siRNAs）、PIWI相互作用RNA（piRNAs）和miRNAs。siRNAs是由RNAseⅢ家族酶dicer處理的雙鏈前體衍生而來(lái)。在哺乳動(dòng)物中，內(nèi)源性siRNA在生殖細(xì)胞中較為豐富，但在無(wú)脊椎動(dòng)物中則更為廣泛。miRNA前體包含成熟miRNA序列的短發(fā)夾片段。這些前體通過(guò)兩個(gè)雙鏈RNA酶（dsRNA酶）Drosha和Dicer的串聯(lián)作用進(jìn)行處理。piRNAs主要在生殖細(xì)胞中表達(dá)，在生殖細(xì)胞中它們保護(hù)轉(zhuǎn)座子的活性。它們的生物起源仍有待充分了解。
（2）小RNA 發(fā)現(xiàn)
下一代測(cè)序技術(shù)使小RNAs的研究發(fā)生了革命性的改變。在將特定的連接子連接到小RNAs之后，可以生成cDNAs，這非常適合使用短讀平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。這些方法擴(kuò)大了被認(rèn)為通過(guò)RISC起作用的小RNAs的種類(lèi)，并使人們能夠發(fā)現(xiàn)新的小RNAs。深度測(cè)序也被證明有助于檢測(cè)特殊小RNA的表達(dá)；另一方面，如微陣列和定量pcr（qpcr），也提供了經(jīng)濟(jì)的替代方案，目前數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)在線提供已知的小RNA庫(kù)。
（3）小RNA 功能研究
了解小RNAs的功能通常從研究它們的表達(dá)模式開(kāi)始。潛在靶點(diǎn)的識(shí)別依賴(lài)于小RNA和靶點(diǎn)必須具有一定的序列互補(bǔ)性的假設(shè)。計(jì)算算法根據(jù)miRNA-mRNA相互作用的假定特征及其結(jié)合位點(diǎn)的保守性預(yù)測(cè)miRNA靶點(diǎn)。此外，還發(fā)展了幾種生物化學(xué)方法，如交聯(lián)免疫沉淀法（CLIP）和串聯(lián)親和純化miRNA靶基因mRNAs（Tap-Tar）。小RNAs的功能研究可以依賴(lài)于常規(guī)的遺傳策略，如基因敲除。miRNA的過(guò)度表達(dá)和miRNA拮抗劑的使用也是常用的方法。拮抗劑是化學(xué)合成的miRNA互補(bǔ)寡核苷酸，其修飾的化學(xué)骨架可作為miRNA功能的反義抑制劑。模式生物，如秀麗隱桿線蟲(chóng)、果蠅和斑馬魚(yú)，也被證明是理解保守小RNAs功能的關(guān)鍵。
（4）小RNA 工具類(lèi)型
小rna通路的抑制潛能可以被重新定位到選定的細(xì)胞基因，使基因功能的研究成為可能。在哺乳動(dòng)物中，有兩種類(lèi)型的RNAi triggers被廣泛應(yīng)用。通常在培養(yǎng)過(guò)程中，siRNAs被瞬時(shí)傳遞到細(xì)胞中，并進(jìn)入RISC而無(wú)需進(jìn)一步處理。shRNAs必須利用瞬時(shí)傳遞或基因組整合的載體進(jìn)行表達(dá)，并且必須經(jīng)過(guò)Drosha和Dicer或Dicer酶處理。siRNAs簡(jiǎn)單易用，但由于化學(xué)合成的triggers的持續(xù)性，它們只能暫時(shí)使目標(biāo)沉默。shRNAs提供了更大的靈活性；整合的結(jié)構(gòu)可以提供長(zhǎng)久性的抑制，shRNAs本身可以由受調(diào)控的啟動(dòng)子表達(dá)，從而能夠調(diào)節(jié)抑制水平并檢查可逆效應(yīng)。
（5）小RNA 篩選工具
小RNA工具徹底改變了全基因組檢測(cè)以尋找對(duì)特定表型有影響的蛋白質(zhì)的能力。在哺乳動(dòng)物全基因組和亞基因組中，合成siRNAs或shRNA表達(dá)載體的文庫(kù)被廣泛使用。此外，長(zhǎng)dsRNAs文庫(kù)已廣泛應(yīng)用于蠕蟲(chóng)和果蠅黑原細(xì)胞中，而且很容易獲得表達(dá)dsRNA觸發(fā)因子的轉(zhuǎn)基因蒼蠅的文庫(kù)。
（6）體內(nèi)研究策略
短發(fā)夾RNAs（shRNAs）是研究轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因功能的有力工具。通過(guò)移植shRNAs修飾的干細(xì)胞，可以培育出敲除目的基因的動(dòng)物。這可以通過(guò)將優(yōu)化的shRNAs整合到能夠在大多數(shù)組織中表達(dá)的特定基因組位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種策略為實(shí)現(xiàn)組織或細(xì)胞類(lèi)型中任何基因的組織特異性或調(diào)節(jié)性抑制提供了可能。
（7）小RNAs 靶向治療
miRNAs自身或關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)的改變與人類(lèi)疾病有關(guān)。這使得對(duì)特定miRNA的調(diào)控正成為一種新的治療手段，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種在體內(nèi)釋放拮抗劑的策略。這些方法已在包括嚙齒動(dòng)物和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物在內(nèi)的臨床前模型中得到驗(yàn)證，一些miRNA拮抗劑已進(jìn)入人類(lèi)臨床試驗(yàn)。
（8）小RNA基因治療應(yīng)用前景
利用小RNAs的單基因和全基因組方法在發(fā)現(xiàn)各種疾病的新治療靶點(diǎn)方面都具有很大的潛力。這些靶點(diǎn)中有些屬于蛋白質(zhì)類(lèi)，這些蛋白質(zhì)類(lèi)可用于常規(guī)藥物的發(fā)現(xiàn)。還有一部分被認(rèn)為是“無(wú)成藥性”的蛋白質(zhì)類(lèi)。在這些情況下，小RNAs本身提供了一種新的治療方法，盡管將小RNA輸送到體內(nèi)的靶細(xì)胞具有挑戰(zhàn)性，但許多研究小組已在尋求在特定疾病環(huán)境中表達(dá)shRNAs的基因治療方法。


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參考文獻(xiàn)：

Chang K, Hannon G J. Tools for studying and using small RNAs: from pathways to functions to therapies[J]. Nature Reviews, Genetics Sep, 2014, 18.

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