PRIMO 助力類器官芯片研究

（ 一） 前言

目前， 微制造（ Microfabrication） 技術可以利用越來越多的材料和工藝在體外創(chuàng)建三
維組織， 生成微芯片， 模擬高度復雜的生理病理條件， 為臨床提供潛在的解決方案。 然而，
微制造是一個復雜的、 多步驟的過程， 制作一個用于特定應用的芯片既費時又費錢， 充滿挑
戰(zhàn)。

（ 二） 類器官芯片舉例

韓國科學家 Kim 利用聚二甲基硅氧烷（ PDMS） 在光刻膠 SU-8 上倒模創(chuàng)造出類器官芯片
 （ 圖 1） 。 通過改變?nèi)四氺o脈內(nèi)皮細胞（ HUVECs） 的培養(yǎng)方法， 形成不同的血管結構。
  圖 1. 不同的實驗設計， HUVECs 細胞在芯片中發(fā)展成血管生成（ Vasculogenesis） 或血
管新生（ Angiogenesis） 。
（ C-D 圖） ： HUVECs 細胞包埋在 3D 纖維蛋白基質中注入中間腔室（ C 部分） ； LFs 細胞
（ 正常人肺成纖維細胞） 包埋在纖維蛋白基質中注入雙外側腔室（ LO 和 RO 部分） ， HUVECs
細胞發(fā)展成血管生成（ Vasculogenesis） 。
（ E-F 圖） ： HUVECs 細胞包被在中間腔室的左側壁， 腔室中是纖維蛋白基質， LFs 細胞
包埋在纖維蛋白基質中注入外右側腔室（ 僅 RO 部分） ， HUVECs 細胞發(fā)展成血管新生
（ Angiogenesis） 。
（ 圖 2） 是對血管生成（ Vasculogenesis） （ 圖 A-D)和血管新生（ Angiogenesis） （ 圖
E-H） 的成像對比。 （ 圖 I） 是 A-D 中管狀物的面積%對比； （ 圖 J） 是 E-H 中平均芽狀物長
度的對比。 可見隨時間進程可形成更多的血管結構。
熒光微珠和 FITC-葡聚糖溶液也可以在生成的血管結構中自由流動， 而不滲出（ 圖 3） ，

說明 HUVECs 細胞生成的血管結構具有功能性。 更多高清圖像請看原文。
 
（三） 用 Aveole PRIMO 設計類器官芯片

在 Kim 的實驗中， 利用普通光刻法制作芯片。 法國 Alveole 公司的 PRIOM“定制化細胞
微環(huán)境制備系統(tǒng)” ， 是一種無掩模和非接觸式的 UV 投射系統(tǒng)， 可以利用紫外線敏感的光刻
膠（photoresists） 快速生成微工程化的細胞微環(huán)境模型。 這項技術簡單、 快捷、 靈活， 可
以用于各類設計的日常創(chuàng)新和優(yōu)化。 如果 Kim 采用 PRIMO 制作芯片， 將更快更好地得到有
功能性的血管結構。

Alveole 的科學家用 PRIMO 設計類器官芯片（organ-on-a-chip） 來模擬造血干細胞的
微生態(tài)環(huán)境（microniche） ， 包括在時空上組織、 模擬它的主要細胞成分， 如成骨細胞、
內(nèi)皮細胞和干細胞 。

3.1 PRIMO 的原理

PRIMO 安裝在倒置顯微鏡上， 根據(jù)上傳到 LEONARDO 軟件的圖案， 借助微鏡片陣列調節(jié)
UV 光線投射的強度、 時間和區(qū)域， 將圖案通過顯微鏡的物鏡投射到樣本上（ 圖 4） 。 可選擇
任意的 PDF 或 TIF 圖案上傳到軟件進行投射。
 
3.2 實驗流程

1） 樣本準備
玻璃晶片上旋轉涂布光刻膠 SU-8 3050 進行一段時間烘培。
2） 用 UV 光照射光刻膠
將玻璃晶片倒置在顯微鏡上， 使光刻膠（ SU-8） 層對準 4x 物鏡（ 圖 5， 步驟 1） 。 通過
LEONARNO 軟件， 將芯片的設計圖像投射到光刻膠層上。 雖然圖像超過了物鏡視野的大小，
還是能被自動切割分別投射， 最后連接在一起， 形成密閉不透水的管路（ 圖 5， 步驟 2 和 3）。
3） 照射后烘焙
對光刻膠基質繼續(xù)進行烘焙和固化（ 圖 5， 步驟 4） 。
4） PDMS（ 聚二甲基硅氧烷） 倒模
獲得的光刻膠（ SU-8） 模具進行硅烷化后， 將 Sylgard 184 PDMS 和固化劑（ 比例 10:1）
倒在光刻膠模具上形成 PDMS 芯片（ 圖 5， 步驟 5） 。 烘焙后， 將 PDMS 芯片從光刻膠模具上
剝下， 放在玻璃載玻片上（ 圖 5， 步驟 6） 。
5） 細胞培養(yǎng)
人臍靜脈內(nèi)皮細胞（ HUVEC） 、 人胎兒成骨細胞（ hFOB） 和造血干細胞（ HSC） 分別重懸
在膠原蛋白/纖維蛋白的水凝膠中， 注射到芯片的不同腔室中進行 3D 培養(yǎng)。
 
3.3 應用： 芯片優(yōu)化和 3D 細胞培養(yǎng)
 
（圖 6A） 是最初的設計（根據(jù) Kim et al.的文獻 ） ， 中間的通道可以注射細胞，兩側的通道既可以注射細胞也可以注射營養(yǎng)物質。
（圖 6B 和 3C） 展示了更復雜的芯片設計， 加上了其他通道。
（圖 6D） 顯示的是 PDMS 芯片的成品， 特殊結構的 PDMS 芯片安裝在玻璃載玻片上， 芯片通道的入口處設計了穿孔裝置， 用來注射細胞進入不同的腔室。
  （圖 7A） 顯示 PDMS 芯片中在 3D 膠原蛋白/纖維蛋白水凝膠中培養(yǎng)的 HUVEC 細胞， 它們
自發(fā)地形成了有功能的血管結構。
（圖 7B） 顯示該結構能夠將熒光微珠從一個腔室傳遞到另一個腔室， 即具有功能性。
（圖 7C） 最終， 研究者將不同類型的細胞注射到芯片的不同的腔室/管道里， 以重現(xiàn)造
血干細胞的微生態(tài)環(huán)境： 頂部腔室里的成骨細胞模擬骨骼成分， 底部腔室里的 HUVEC 細胞
模擬血管成分， 造血干細胞被注射進入中間的通道。

（四） 實驗結論

因為可以基于圖像進行無掩模的 UV 投射， PRIMO 是進行微制造快速建模的強有力工具，
可以用于日常的靈活的創(chuàng)建新模型。 通過投射得到的 SU8 結構可以被用來作為模具， 創(chuàng)造
PDMS 芯片， 各種細胞就可以在分割的腔室中進行 3D 生長。 研究者將 3 種不同的細胞在芯片
的不同腔室里培養(yǎng)數(shù)日， 展示了這個芯片的極佳的生物相容性。 生成的類器官芯片被用來
模擬造血干細胞的微生態(tài)環(huán)境。

（五） PRIMO 介紹

PRIMO 的芯片微制造（Microfabrication） 的實驗原理可參考： 生物建模的黑科技——
快捷精準的“定制化細胞微環(huán)境制備系統(tǒng)” （下） 。

5.1 PRIMO 的主要特點和優(yōu)勢【3】 ：

無掩模： 非接觸式、 無掩模 UV 投射成像（波長λ =375nm） ， 可靈活控制 UV 的強度、 照
射時間、 區(qū)域；
自動化： 全自動快速定制， 可針對實驗條件進行快速優(yōu)化；
高靈活性： 可按照任意圖案去構建您的基質和/或使其功能化， 不限圖案的大小和復雜
程度， 生成不同的細胞模型；
多樣性/兼容性： 適用于常規(guī)的細胞培養(yǎng)基質， 基質可為平面或有微結構， 可硬可軟，
如： 玻璃蓋玻片、 塑料培養(yǎng)皿、 聚二甲基硅氧烷（PDMS） 、 聚苯乙烯、 水凝膠（PEG 丙
烯酸酯、 聚丙烯酰胺凝膠、 瓊脂、 基質膠） 、 光刻膠， 等；
常 用 蛋 白 ： 我 們 的 客 戶 日 常 使 用 超 過 10 種 的 各 類 蛋 白 ： Fibrinogen-488,
Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647,
PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初級和次級抗體， 等；

高分辨率： 全視野分辨率為 1.2µm（500× 300µm ， 20 倍物鏡） ；
多層次： 可蝕刻 256 個灰階層次， 粘附不同密度層次的蛋白；
多種蛋白： 可應用 3 種不同蛋白（根據(jù)實驗需求） ；
自動對齊： 自動進行檢測和圖案定位， 可自動對齊于微結構或者微圖案上；
速度快： 蝕刻 500× 300µm 圖案， 20 倍物鏡， 僅需 30s。

5.2 PRIMO 的應用領域

PRIMO 強大的生物建模能力和對細胞微環(huán)境的控制， 可以為多種生物學實驗帶來全新
的、 突破性視角， 可用于研究細胞遷移/趨觸性、 細胞黏附、 2D/3D 細胞標準化培養(yǎng)、 細胞
球培養(yǎng)、 生物力學、 組織工程、 微流體芯片， 等多個領域。

（六） 附錄

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