長非編碼RNA在下丘腦中抗衰老的機制

近日，中南大學湘雅醫(yī)學院羅湘杭團隊的研究成果在國際頂級代謝期刊Cell Metabolism（IF = 22.415）刊登，文章標題為《Reducing Hypothalamic Stem Cell Senescence Protects against Aging-Associated Physiological Decline》。該研究在下丘腦的神經(jīng)干細胞中發(fā)現(xiàn)一種名為Hnscr（htNSCs-related）的長非編碼RNA（lncRNA）能夠與YB-1（Y-box Protein 1）蛋白結(jié)合，并抑制YB-1蛋白的降解。而YB-1又能抑制衰老相關(guān)的蛋白的表達，而且還能恢復衰老小鼠的記憶認知和肌肉平衡等功能。并且通過對YB-1蛋白與Hnscr結(jié)合區(qū)域的結(jié)構(gòu)分析，篩選到了一種叫做TF2A的天然化合物，該化合物能夠模擬Hnscr的功能，通過抑制YB-1的降解，從而降低衰老相關(guān)蛋白的表達，也能起到對小鼠衰老表型的恢復作用。

 

研究背景

 

衰老是生物界的法則，任何有生命的個體都無法逃脫從一誕生就走向衰老，直至死亡這一過程。人類從古至今孜孜不倦地尋找長生不老之法，中國古代從秦皇漢武，到明清的嘉靖雍正，為此無不耗費了巨大財力和人力。即便是在現(xiàn)在，人們依然在尋找長壽的秘訣。但目前能做到的只能想方設(shè)法將這一過程延緩，提高衰老過程中的人類的生活質(zhì)量。因此對衰老的深層生物學機制的研究可以幫助我們更好地有的放矢，尋找能夠幫助人類延緩衰老的方案。

 

目前引起衰老的9大原因：

 

1. 基因組不穩(wěn)定性增加（genomic instability）

 

2. 端�？s短（telomere attrition）

 

3. 表觀遺傳學改變（epigenetic alterations）

 

4. 蛋白內(nèi)穩(wěn)態(tài)喪失（loss of proteostasis）

 

5. 營養(yǎng)感應失調(diào)（deregulated nutrient sensing）

 

6. 線粒體功能異常（mitochondrial dysfunction）

 

7.細胞間信息傳遞改變（altered intercellular communication）

 

8. 干細胞枯竭（stem cell exhaustion）

 

9. 細胞衰老（cellular senescence）

 

圖1. 衰老的九大標志（引自Lopez-Otin et al., 2013 ）

 

目前有研究發(fā)現(xiàn)下丘腦的功能對人體的衰老有著重大的影響。下丘腦位于大腦腹面，基本與人的耳朵和眼睛處于同一平面。是調(diào)節(jié)內(nèi)臟，代謝和內(nèi)分泌的重要腦區(qū)，能調(diào)節(jié)垂體對激素的分泌，控制如體溫、飲水，攝食、性活動、打斗等行為。2017年，有研究團隊發(fā)現(xiàn)小鼠下丘腦的神經(jīng)干細胞隨年齡增長而逐漸衰老死亡，并伴隨著如肌肉耐力、社交能力以及記憶力等衰老表型的出現(xiàn)；如果將新生小鼠的神經(jīng)干細胞移植到中年小鼠相應的腦區(qū)，則會使小鼠重新獲得生命活力。因此，神經(jīng)干細胞尤其是下丘腦神經(jīng)干細胞（hypothalamus Neural Stem Cells, htNSCs）的研究可能幫助人們找到對抗衰老的利器。

 

圖2. 人類下丘腦（引自NIH）

 

目前的研究認為，在人類的編碼RNA中，真正編碼蛋白的只占30%左右，其余的非編碼RNA還包括小干擾RNA(miRNA)、小核RNA/核仁小RNA（snRNA/snoRNA）、假基因RNA、雜RNA和長非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)。在這些非編碼RNA中，lncRNA長度大于200個核苷酸，占總編碼基因的35~40%左右。和其他的非編碼RNA一樣，有一定的時空表達特異性，能夠調(diào)節(jié)編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄，在高等生物的發(fā)育和組織分化等過程中起著重要作用。

 

圖3. 長非編碼RNA(lncRNA)(引自Atianand et al., 2014)

 

相比之下，小鼠的lncRNA數(shù)量較少，但也具有不可忽視的重要作用。總體而言，不同物種之間的lncRNA保守性不是很高，并不是所有的人類lncRNA都能在常用的模式動物中找到同源物。

 

研究內(nèi)容

 

2.1 影響下丘腦衰老的長非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)

 

在實驗室條件下，小鼠的壽命一般為24個月。研究人員對比了3個月（年輕）和18個月（中年）小鼠下丘腦神經(jīng)干細胞的生長情況，發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)7-10天后，年輕小鼠的下丘腦神經(jīng)干細胞（神經(jīng)干細胞在體外培養(yǎng)時一般會從單個細胞分裂成一團細胞，這些細胞聚集成球狀，其狀態(tài)可表征神經(jīng)干細胞的活性）形成神經(jīng)球的數(shù)量和大小都要高于中年小鼠，說明年輕小鼠的下丘腦神經(jīng)干細胞數(shù)量和活性都要高于中年小鼠。

 

那么，這種差異是如何產(chǎn)生的呢?使用RNAseq對這些神經(jīng)球進行檢測，發(fā)現(xiàn)一種被命名為Hnscr（htNSCs-related）的lnc-RNA在年輕小鼠的表達要顯著高于中年小鼠，而且這種lnc-RNA與人類高度同源，選擇其進行研究有利于后續(xù)向人類相關(guān)lncRNA研究的轉(zhuǎn)化。通過RT-PCR檢測也發(fā)現(xiàn)Hnscr不但在3個月和18個月的小鼠中存在顯著差異，而且隨著年齡的增長表達逐漸降低。

 

圖4. 年齡對htNSCs形成神經(jīng)球的影響及Hnscr表達隨年齡減少

 

2.2 Hnscr敲除小鼠抑制htNSCs活性并誘發(fā)衰老表型

 

這里用到的Hnscr敲除小鼠（賽業(yè)生物科技提供）年輕的時候（3月齡）在大部分基本表型上與對照小鼠相比，在體重、行為以及生育等方面沒有差異。但當小鼠到了18個月的時候，轉(zhuǎn)基因小鼠的htNSCs出現(xiàn)了明顯的病理表型，包括形成神經(jīng)球的數(shù)量減少，體積減��；衰老神經(jīng)元的增加；分化能力變?nèi)酢?/p>

 

圖5. 敲除hnscr基因?qū)�htNSCs的影響

 

上述的這些研究都是神經(jīng)干細胞在離體培養(yǎng)中發(fā)生的改變。那么具體到動物的表型上又有哪些改變呢？

 

研究人員通過一系列的行為實驗發(fā)現(xiàn)Hnscr敲除小鼠的肌肉持久力變?nèi)�，動作的協(xié)調(diào)性變差，運動能力降低，與其他小鼠的互動減少，同時空間記憶能力也不如同窩對照小鼠。這一系列的衰老表型導致了Hnscr敲除小鼠的壽命顯著降低。

 

圖6. 敲除hnscr基因?qū)π∈蟊硇偷挠绊?/span>

 

2.3 局部抑制Hnscr抑制小鼠htNSCs活性并誘發(fā)衰老表型

 

雖然已經(jīng)證實了Hnscr對下丘腦神經(jīng)干細胞和小鼠認知功能的影響，但是由于轉(zhuǎn)基因小鼠的Hnscr缺失是全身性的，具體到下丘腦干細胞對衰老的影響還無法下定論。因此研究人員采用腦定位注射的方法，用腺病毒包裝SOX2啟動子和Hnscr-shRNA注射進入14月齡小鼠下丘腦內(nèi)側(cè)基底（Mediobasal Hypothalamic，MBH）抑制Hnscr的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Hnscr敲除小鼠一樣，htNSCs的神經(jīng)球數(shù)量減少，體積減�。凰ダ仙窠�(jīng)元增加；分化能力變?nèi)酢?/p>

 

圖7. 局部注射sh-hnscr抑制Hnscr對htNSCs的影響

 

此外，在動物行為方面，小鼠除了社交能力沒有明顯變化以外，其他的注射了sh-hnscr的小鼠發(fā)生了和基因敲除小鼠一致的表型。

 

圖8. 局部注射sh-Hnscr對野生型小鼠表型的影響

 

2.4 YB-1受Hnscr調(diào)節(jié)并參與對小鼠htNSCs衰老的抑制

 

那么，Hnscr究竟是怎樣影響小鼠htNSCs的改變并作用到小鼠衰老表型的呢？通過RNA-pulldown后的質(zhì)譜檢測（找出與該RNA結(jié)合的豐度最高的蛋白），免疫印跡（用抗體確定就是YB1蛋白），免疫共沉淀（進一步證明結(jié)合）等多種方法證明Hnscr是與一種YB-1（Y-box Protein 1）的蛋白具有高度的親和力。并且還發(fā)現(xiàn)Hnscr影響的是YB-1的蛋白水平而非RNA轉(zhuǎn)錄水平。接下來通過蛋白酶抑制劑的使用和泛素化實驗，研究人員確定了Hnscr能夠抑制YB-1的泛素化降解，從而提高YB-1在神經(jīng)細胞中的豐度。

 

注：YB-1是一種能夠結(jié)合DNA和RNA的蛋白，通常在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中發(fā)揮作用，并作用于pre-RNA的剪切、DNA的修復以及參與核糖核蛋白的組裝，還有研究發(fā)現(xiàn)YB-1能夠在microRNA的加工中起作用，其不正常表達跟多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。

 

圖9. Hnscr抑制YB-1降解

 

為了進一步明確Hnscr和YB-1對衰老的影響，在Hnscr敲除小鼠中研究人員用RT-PCR的方法檢測發(fā)現(xiàn)Hnscr或者YB-1減少均會導致p16INK4A mRNA表達量的增加。Hnscr的減少會降低YB-1的表達，反過來YB-1的增加卻不會提高Hnscr的水平，說明Hnscr在通路中位于YB-1的上游。對mRNA的表達一致，YB-1的增加也會抑制p16INK4A 蛋白的表達。研究人員繼續(xù)對htNSCs的活性和衰老狀態(tài)進行了檢測，發(fā)現(xiàn)增加YB-1也能抑制其衰老并提高分化活性。

 

注：p16INK4A與衰老相關(guān)，可以看做是一種衰老標志物蛋白，但該蛋白也是一種抑癌基因，其活性的降低在多種腫瘤細胞中也比較常見。

 

圖10 . YB-1對Hnscr缺失小鼠p16INK4A和htNSCs影響

 

2.5 TF2A抑制YB-1降解并緩解htNSCs及小鼠的衰老

 

無論是YB-1還是Hnscr，直接應用于對抗人類的衰老都是相當困難的，那么有沒有一種物質(zhì)能夠模擬Hnscr的作用，抑制YB-1進行的降解，從而抑制衰老呢？研究人員從分子化合物庫中篩選得到了一種名為TF2A（茶黃素3-沒食子鹽酸，Theaflavin 3-Gallate）的物質(zhì)，該物質(zhì)在經(jīng)過發(fā)酵的紅茶中含量豐富，而紅茶又是中國南方地區(qū)廣泛流行的飲品。在蛋白合成抑制劑CHX的存在的條件下，實驗發(fā)現(xiàn)TF2A能夠和Hnscr一樣抑制YB-1的降解，并能抑制YB-1的泛素化，而且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著TF2A濃度的提高，YB-1的豐度逐漸提高。

 

圖11.  TF2A抑制YB-1降解

 

研究者也補充了細胞表型和動物行為方面的實驗，結(jié)果顯示TF2A對htNSCs起到的恢復效果基本和外源增加Hnscr與YB-1所產(chǎn)生的效果一致，不過對小鼠肌肉和運動協(xié)調(diào)恢復有明顯效果，對認知和社交這類高級認知功能也體現(xiàn)出了部分作用，不過統(tǒng)計上并沒有與對照產(chǎn)生統(tǒng)計學上的顯著差異。值得注意的是，TF2A是通過飲用水給小鼠服用的，說明該物質(zhì)易用性很好。

 

圖12. TF2A抑制htNSCs衰老并改善小鼠衰老表型

 

全文總結(jié)及展望

 

總結(jié)下來，本文的研究思路十分清晰：

 

1. 對比lncRNA在不同年齡之間htNSCs的表達差異，根據(jù)表達變化幅度以及與人類的親源關(guān)系等限定條件找到Hnscr；

 

2. 利用基因編輯敲除小鼠Hnscr，研究Hnscr對htNSCs以及小鼠表型的影響；

 

3. 通過腦定位注射shRNA精準抑制小鼠下丘腦神經(jīng)干細胞中的Hnscr，探究該區(qū)域htNSCs的改變，驗證Hnscr敲除小鼠中該長非編碼RNA的功能；

 

4. 通過多種方法找到Hnscr高親和力蛋白YB-1，先確定Hnscr抑制YB-1降解，并驗證YB-1對htNSCs和小鼠表型的影響；

 

5. 通過數(shù)據(jù)庫和實驗篩選出功能類似于Hnscr的小分子化合物，并驗證其在小鼠下丘腦干細胞和動物表型中發(fā)揮的作用。

 

 

該研究不僅揭示了下丘腦中神經(jīng)干細胞影響衰老的深層機理，加強了人們對衰老過程的認識，還發(fā)現(xiàn)了一種能夠模擬抗衰老長非編碼RNA的化合物——TF2A。長久以來就有喝茶有益健康，延年益壽的說法。TF2A是發(fā)酵紅茶中的一種成分，早在上世紀50年代就已經(jīng)被分離出來。該研究采用現(xiàn)代生物學的方法，通過多角度的深入研究，發(fā)現(xiàn)了其在抗衰老作用的深層機理，在人類追求高品質(zhì)的老年生活的道路上邁出了堅實的一步。

 

參考文獻：

1. Xiao et al., Reducing Hypothalamic Stem Cell Senescence Protects against Aging-Associated Physiological Decline, Cell Metabolism (2020)

2. Zhang et al., Hypothalamic stem cells control ageing speed partly through exosomal miRNAs. Nature (2017), 548(7665), 52–57.

3. Lopez-Otin et al., The hallmarks of aging. Cell (2013) 153, 1194–1217.

4. Atianand et al., Long non-coding RNAs and control of gene expression in the immune system. Trends in Molecular Medicine (2014), 20(11), 623–631.