MaxCyte流式電轉(zhuǎn)染平臺(tái)在新一代疫苗快速研發(fā)生產(chǎn)中的優(yōu)勢(shì)分析

 

日前，新型冠狀病毒（COVID-19）疫情仍在持續(xù)發(fā)展，截至目前，累計(jì)確診病例數(shù)已超過(guò)70000。盡管統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)在不斷增加，但全國(guó)乃至全球抗擊疫情的決心和信心越來(lái)越強(qiáng)。對(duì)于疫情防控，其中最重要的研究工作是要盡早研發(fā)出針對(duì)2019-nCoV感染的預(yù)防性疫苗。研究表明，如果人群中有70%以上的人接種了相應(yīng)疫苗，就有可能有效阻斷病毒在人群中的廣泛傳播。對(duì)普通民眾來(lái)說(shuō)，疫苗仍然是防控傳染病最有效的手段。大家越來(lái)越關(guān)心疫苗研制目前在什么階段、什么時(shí)候能夠上市。

那么，什么是疫苗？疫苗研發(fā)需要多久？疫苗是將病原微生物（如細(xì)菌、病毒、立克次體）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)人工減毒滅活或利用基因工程等方法制成的，用于預(yù)防傳染病的自動(dòng)免疫制劑。18世紀(jì)末英國(guó)人簡(jiǎn)納（E.Jenner）在人痘接種基礎(chǔ)上發(fā)明了牛痘接種術(shù)，標(biāo)志著歷史上第一劑疫苗發(fā)明，是古典疫苗時(shí)期的開(kāi)始。隨著微生物學(xué)的發(fā)展及當(dāng)時(shí)霍亂、炭疽桿菌以及狂犬病，19世紀(jì)末法國(guó)科學(xué)家巴斯德通過(guò)系統(tǒng)的科學(xué)實(shí)驗(yàn)，將病原微生物進(jìn)行培養(yǎng)、減毒或滅活，使其毒力降低或消失，制出了雞霍亂桿菌菌苗、炭疽菌苗、狂犬病毒疫苗等。最近幾十年遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程等學(xué)科得到飛速發(fā)展，研制疫苗的技術(shù)水平也不斷提升�？茖W(xué)家通過(guò)提取或人工合成病原微生物的有效抗原成分而制成亞單位疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗等，這類(lèi)疫苗安全，副作用較少，無(wú)毒力返祖的危險(xiǎn)。

 

 

對(duì)于甲流等大規(guī)模流行性傳染疾病，疫苗的生產(chǎn)主要還是利用傳統(tǒng)方法，以雞胚為載體來(lái)培養(yǎng)種子毒株，獲得滅活或減毒疫苗，但研發(fā)及生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，當(dāng)年SARS滅活疫苗研制出來(lái)的時(shí)候病毒都已經(jīng)銷(xiāo)聲匿跡，甚至都沒(méi)有在臨床上進(jìn)行使用。據(jù)報(bào)道，國(guó)內(nèi)外超過(guò)30家團(tuán)隊(duì)已經(jīng)開(kāi)展針對(duì)新冠病毒的疫苗研發(fā)，其中核酸和重組蛋白等疫苗研發(fā)團(tuán)隊(duì)不僅占據(jù)了大多數(shù)，而且進(jìn)展也相當(dāng)快，美國(guó)Moderna公司和上海斯微的mRNA疫苗、中科院微生物所的重組蛋白疫苗等已經(jīng)在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

 

當(dāng)前部分新冠病毒疫苗研發(fā)機(jī)構(gòu)和企業(yè)

機(jī)構(gòu)/企業(yè)	疫苗類(lèi)型
中國(guó)疾控中心	傳統(tǒng)滅活疫苗
浙江大學(xué)傳染病診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室	傳統(tǒng)滅活疫苗
斯微生物/同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院	mRNA疫苗
中科院先進(jìn)技術(shù)研究院	mRNA疫苗
美國(guó)Moderna公司	mRNA疫苗
美國(guó)CureVac公司	mRNA疫苗
美國(guó)Inovio公司	DNA疫苗
中科院微生物研究所	重組蛋白疫苗
香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院	重組蛋白疫苗
澳大利亞昆士蘭大學(xué)	重組蛋白疫苗
成都三葉草生物制藥	重組蛋白疫苗
武漢博沃公司/美國(guó)GeoVax Labs	病毒載體疫苗
美國(guó)強(qiáng)生公司	腺病毒載體疫苗

 

疫苗是目前人類(lèi)唯一可以有預(yù)測(cè)地消滅某一疾病的有效武器，但是疫苗本身也存在局限性，病毒一旦發(fā)生變異，原有的疫苗也即失去功效。且疫苗研制周期漫長(zhǎng)，得益于核酸、重組蛋白等新型疫苗研究技術(shù)，目前針對(duì)COVID-19的疫苗最早4月份進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)，比SARS疫苗研制進(jìn)展提高了很多，但是距離上市還有相當(dāng)一段時(shí)間，面對(duì)此次傳播力如此強(qiáng)的病毒，疫苗早一天上市就可能多挽救一批奮戰(zhàn)在一線的醫(yī)務(wù)人員及無(wú)辜感染者。
 

MaxCyte公司是全球電轉(zhuǎn)領(lǐng)域的先行者和技術(shù)領(lǐng)導(dǎo)者，專注細(xì)胞電轉(zhuǎn)技術(shù)超過(guò)20年，提供全球領(lǐng)先的細(xì)胞轉(zhuǎn)染解決方案，其專利性的通用型流式電轉(zhuǎn)染技術(shù)是經(jīng)臨床驗(yàn)證的快速、高質(zhì)量細(xì)胞轉(zhuǎn)染平臺(tái)，能夠?qū)�DNA、RNA、siRNA、蛋白質(zhì)或細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞系和原代細(xì)胞中，系統(tǒng)內(nèi)置多種經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)方案，轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率可達(dá)90%以上，能夠在30分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)染多達(dá)2×10¹⁰個(gè)細(xì)胞，放大生產(chǎn)無(wú)需再次優(yōu)化轉(zhuǎn)染流程，適用于前期研發(fā)、臨床實(shí)驗(yàn)到商業(yè)化生產(chǎn)全過(guò)程，且符合cGMP生產(chǎn)規(guī)范，操作簡(jiǎn)單，系統(tǒng)“即插即用”。 MaxCyte轉(zhuǎn)染平臺(tái)可用于重組蛋白和疫苗研發(fā)及生產(chǎn)，高性能瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)能夠快速開(kāi)發(fā)和制造完整、大量的新一代疫苗，包括治療性抗體和抗體樣分子、亞單位疫苗、病毒樣顆粒（VLPs）、病毒樣復(fù)制子顆粒（VRPs）和病毒載體，無(wú)需其它穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞、桿狀病毒、脂質(zhì)體或化學(xué)轉(zhuǎn)染方式，能夠大大縮減抗體和疫苗從研制到上市的時(shí)間。

 

MaxCyte通用流式細(xì)胞電轉(zhuǎn)染平臺(tái)

 

圖1. 高性能瞬時(shí)轉(zhuǎn)染                                           圖2.  快速大量蛋白生產(chǎn)
 

MaxCyte系統(tǒng)利用流式電轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、干細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞，具有高轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活率，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞、細(xì)胞表面或分泌蛋白的高水平表達(dá)。MaxCyte瞬時(shí)轉(zhuǎn)染平臺(tái)可快速生產(chǎn)大量用于治療或疫苗的蛋白質(zhì)，包括單特異性和多特異性抗體、VLP、VRP、包膜蛋白、其他重組蛋白，以及來(lái)自CHO、HEK、Vero、昆蟲(chóng)細(xì)胞和各種其他細(xì)胞系的病毒載體。MaxCyte瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞在兩周內(nèi)能夠獲得大于1g/L抗體產(chǎn)量，滿足臨床前實(shí)驗(yàn)所需蛋白量，且放大生產(chǎn)無(wú)需重新優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法，無(wú)論是少量還是大量轉(zhuǎn)染產(chǎn)量都具有極高的穩(wěn)定性，可極大縮短抗體研發(fā)到生產(chǎn)的時(shí)間。此外，流動(dòng)電轉(zhuǎn)染的高轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率使得在瞬時(shí)運(yùn)行的同時(shí)選擇穩(wěn)定的細(xì)胞系，進(jìn)一步簡(jiǎn)化抗體的研發(fā)流程，可在轉(zhuǎn)染后8周內(nèi)產(chǎn)生高產(chǎn)穩(wěn)定的克隆。

MaxCyte助力新一代疫苗快速研發(fā)生產(chǎn)
利用MaxCyte流式電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)直接轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，不使用桿狀病毒做載體，從質(zhì)粒到蛋白表達(dá)的時(shí)間縮短到數(shù)天（圖3）。對(duì)于大規(guī)模傳染病病、生物防御及季節(jié)性流感的快速反應(yīng)疫苗生產(chǎn)會(huì)有很大幫助。MaxCyte轉(zhuǎn)染過(guò)程的簡(jiǎn)單性能夠顧及到區(qū)域性的“盒裝疫苗”生產(chǎn)設(shè)施，同樣的平臺(tái)也可用于其他相關(guān)細(xì)胞類(lèi)型的生物制造，如CHO、HEK、Vero和MDCK細(xì)胞。

MaxCyte用于病毒載體、VLP和疫苗生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)：

• 無(wú)縫放大生產(chǎn)， 30分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)染多達(dá)2×10¹⁰個(gè)細(xì)胞
• 適用多種病毒生產(chǎn)細(xì)胞系
• 無(wú)需桿狀病毒系統(tǒng)在數(shù)天內(nèi)獲得目的蛋白
• 能夠共轉(zhuǎn)染多個(gè)質(zhì)�；虼筚|(zhì)粒
• 軟件控制，封閉轉(zhuǎn)染環(huán)境
• FDA批準(zhǔn)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù) 

病毒樣顆粒（VLP）比滅活或減毒活病毒疫苗具有更高的安全性，是很有前景的疫苗生產(chǎn)技術(shù)。VLPs由一個(gè)或多個(gè)重組表達(dá)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白組成，這些蛋白自組裝成復(fù)合物，緊密模仿原生病毒的三維結(jié)構(gòu)，可用于多種病毒，包括流感病毒。VLPs是用包括哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞制造的。因?yàn)樗鼈冊(cè)诜�譯后以類(lèi)似哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方式修飾蛋白質(zhì)。雖然瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和重組桿狀病毒平臺(tái)都是昆蟲(chóng)細(xì)胞蛋白表達(dá)的常用方法，但MaxCyte電轉(zhuǎn)染技術(shù)為VLP的產(chǎn)生提供了一種更快速和直接的方法。

通過(guò)MaxCyte電轉(zhuǎn)染將編碼三種VLP抗原的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到SF9細(xì)胞，同時(shí)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)被用于產(chǎn)生含有相同三種抗原的VLPs。在48小時(shí)內(nèi)經(jīng)電轉(zhuǎn)染的細(xì)胞即開(kāi)始顯著分泌VLP，細(xì)胞上清液的SDS-PAGE分析顯示，在電轉(zhuǎn)染和桿狀病毒樣本中均存在三種VLP抗原，但桿狀病毒感染細(xì)胞的上清液中也存在桿狀病毒蛋白污染物，利用MaxCyte電轉(zhuǎn)染技術(shù)直接轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞具有極其快速和高質(zhì)量的特性，通過(guò)消除桿狀病毒的使用，簡(jiǎn)化了VLP的生產(chǎn)流程。

 

圖3. MaxCyte生產(chǎn)SF9 VLP：2-4天內(nèi)實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)。用一個(gè)編碼三種抗原的質(zhì)粒通過(guò)小規(guī)模電轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞，共組裝成VLPs。從電轉(zhuǎn)后或桿狀病毒感染后不同時(shí)間中收集細(xì)胞培養(yǎng)液，并用SDS-PAGE進(jìn)行分析。
 

Alphaviruses具有廣泛的細(xì)胞傾向性，但優(yōu)先感染樹(shù)突狀細(xì)胞，來(lái)充當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞（APCs）的傳遞載體，進(jìn)而刺激體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。甲病毒衍生顆粒VRPs（病毒樣復(fù)制子顆粒），代表了下一代疫苗研發(fā)技術(shù)，特別是針對(duì)NIH風(fēng)險(xiǎn)3組病毒（如H5N1、HIV、埃博拉等），因?yàn)榈蜕�物接觸設(shè)施可用于生產(chǎn)非致病性VRPs。VRP對(duì)致病因子和癌癥免疫治療的作用已經(jīng)被評(píng)估，并證明在多種動(dòng)物和人類(lèi)中是安全的，并能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。

VRP的制備是通過(guò)表達(dá)抗原（以mRNA或DNA質(zhì)粒的形式）的甲病毒載體和表達(dá)甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的輔助RNA或DNA質(zhì)粒瞬時(shí)（共）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后收獲含有VRP的培養(yǎng)基，Vero和BHK是最常用的細(xì)胞系，但其他的包括CHO和HEK也被使用。通過(guò)Vero細(xì)胞電轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的VRPs已進(jìn)入臨床研究。

電轉(zhuǎn)染技術(shù)是一種高效轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞的方法。利用MaxCyte進(jìn)行甲病毒VRP實(shí)驗(yàn)，比較了當(dāng)前的最優(yōu)方法。評(píng)估兩種VRP的制備，一種表達(dá)綠色熒光蛋白，另一種表達(dá)HIV-Gag蛋白。對(duì)于這兩種轉(zhuǎn)染方法，基于RNA的輔助結(jié)構(gòu)支持更高水平的VRP產(chǎn)生，特別是對(duì)于基于MaxCyte電轉(zhuǎn)染的方法，其VRP產(chǎn)生率是使用RNA的5倍。當(dāng)使用RNA復(fù)制子和RNA輔助子時(shí)，電轉(zhuǎn)染導(dǎo)致GFP和HIV-Gag表達(dá)VRPs的產(chǎn)量比當(dāng)前最佳方法高9倍。

 

圖4. MaxCyte電轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染技術(shù)產(chǎn)生顯著增加的VRP產(chǎn)量
 

此次新冠病毒給中國(guó)造成了巨大創(chuàng)傷，相信疫情終將過(guò)去，我們的生活也終將歸于平靜，但是人類(lèi)和病毒的較量永遠(yuǎn)不會(huì)停止，人類(lèi)研發(fā)疫苗的腳步也不會(huì)停止。無(wú)論是高致病性的H1N1、COVID-19、SARS，或是高致死率的MERS、Ebola，還是人類(lèi)斗爭(zhēng)了幾十年的HIV等，每一次面對(duì)病毒的進(jìn)攻人類(lèi)好像始終都沒(méi)有做好充足準(zhǔn)備，而且你永遠(yuǎn)無(wú)法預(yù)知下一次病毒爆發(fā)是什么時(shí)候，除了保持警惕防患未然，或許我們還需要做的是讓我們武器庫(kù)里的武器始終保持鋒利。我們期待疫情即早得到控制，我們期待疫苗研發(fā)及早成功利國(guó)利民！