案例解析 | 抗病毒生物大分子制藥治療

近期爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19，對應(yīng)的病毒為SARS-CoV-2）突出了開發(fā)有效治療方法的重要性。在近期的公眾號中，我們向大家介紹了“人民的希望”瑞德西韋的工作機制[1]，在此，我們結(jié)合疫苗、血清、多肽和單抗的研究案例，向大家繼續(xù)介紹靶向病毒的大分子治療和我們的解決方案是如何推動下一代治療研究的。

 

No.1針對MERS的疫苗優(yōu)化研究

 

中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)，是近年來第二個造成大規(guī)模人群傳染的冠狀病毒，相較于SARS病毒，其致死率高、發(fā)病快，因此急需研發(fā)有效的疫苗用于被動免疫。在2015年由NIH的Barney S. Graham主導(dǎo)的研究中，科學(xué)家評價和比較了靶向MERS的多種疫苗方案[2]。

 

基于DNA和蛋白為免疫原的免疫流程，圖片源自參考資料2。

 

圍繞MERS冠狀病毒的刺突蛋白(S)，研究構(gòu)建了多種cDNA和蛋白免疫原，分別通過電轉(zhuǎn)和配合佐劑的形式免疫小鼠。為了提升研究的安全性，科學(xué)家建立了帶有化學(xué)發(fā)光報告基因的假病毒體系。通過檢測由病毒感染所致的化學(xué)發(fā)光，研究利用可溶性DPP4（MERS 靶點）和DPP4抗體驗證了假病毒的功能。

 

MERS假病毒功能性驗證，左圖：基于過表達技術(shù)驗證DPP4過表達提升病毒的感染能力，Huh7.5內(nèi)源性高表達DPP4。中圖：基于可溶性DPP4的競爭實驗。右圖：利用DPP4抗體抑制假病毒的感染。假病毒的化學(xué)發(fā)光檢測基于96-well white/black Isoplate微孔板和Microbeta平臺。圖片源自參考資料2。

 

借助假病毒體系，研究追蹤和評價了不同免疫策略產(chǎn)生的血清的中和能力和針對多種MERS病毒株的交叉中和能力。從結(jié)果可以看出，全程S1蛋白和2X S DNA-S1蛋白的免疫方案所獲得的抗體最為有效，且能中和多種MERS病毒株。通過進一步的競爭實驗和血清吸附實驗，研究證實不同的免疫流程得到的血清靶向的S蛋白位置也不一樣。與經(jīng)典的微量中和實驗(Microneutralization)相比，研究證實假病毒體系評價抗體中和能力更為敏感，靈敏度約有一個數(shù)量級的提升。通過解析抗體的亞型，研究發(fā)現(xiàn)基于S DNA的免疫方案能誘導(dǎo)IgG2a為主導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而S1蛋白刺激則產(chǎn)生IgG1為主導(dǎo)的免疫反應(yīng)。在小鼠中，IgG2a的出現(xiàn)反映了Th1型免疫反應(yīng)，促進了抗病毒相關(guān)因子如interferon-γ的釋放，提升了T細胞介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)。因此，相較于蛋白，基于DNA的疫苗可以通過建立T輔助細胞免疫應(yīng)答來更有效的控制病毒感染。

 

血清的交叉中和能力檢測。假病毒的化學(xué)發(fā)光檢測基于96-well white/black Isoplate微孔板和Microbeta平臺。圖片源自參考資料2。

 

對應(yīng)的，在非人靈長類動物（印度恒河猴）模型上，全程S1蛋白和2X S DNA-S1蛋白的免疫方案產(chǎn)生的中和抗體滴度優(yōu)越于基于全程DNA的免疫方案。病毒接種后，相較于對照組，免疫組動物顯著降低肺部病理指標。疫苗中DNA免疫原的引入更是進一步緩解肺部的損傷情況，并加速了康復(fù)過程。

 

基于非人靈長類動物（印度恒河猴）模型的疫苗評價。上圖：免疫流程。下左圖：動物血清中和實驗，基于96-well white/black Isoplate微孔板和Microbeta平臺。下右圖：通過CT評價疫苗的保護作用。圖片源自參考資料2。

 

No.2基于轉(zhuǎn)基因牛的抗病毒血清研究

 

在抗擊SARS和流感的臨床療法中，“恢復(fù)期血漿”治療(Convalescent‑phase plasma therapy)獲得了一定的成效，有效降低了死亡率。但是，該法的療效很大程度上依賴于是否能及時獲得有效的血清。相比下，基于動物的超免疫血清雖然能解決量的問題，但其使用可能會導(dǎo)致嚴重的免疫反應(yīng)和毒性。單克隆抗體療法，又一種基于被動免疫的治療方法，面臨耗時長和出現(xiàn)耐藥突變病毒株等挑戰(zhàn)。

 

為了解決上述的問題，有研究人員將目光轉(zhuǎn)向了轉(zhuǎn)基因牛(Transchromosomic (Tc) bovines)來快速獲得大量、有效的抗病毒血清。通過基因工程，研究人員敲除牛自身的IgG，并引入完整的、可指定IgG亞型人抗體表達體系，來達到免疫系統(tǒng)人源化的效果。免疫后的牛每只每月可提供高達150到600 g的人IgG。目前，已有多項臨床前研究利用該技術(shù)對抗MERS和Ebola等傳染病[3,4]。在此，我們著重介紹靶向MERS的研究。

 

 

在免疫原段，該研究利用了兩種材料：滅活的Jordan病毒株(WKVV)和基于Al-Hasa病毒株S蛋白的納米材料(SPNV)。兩種免疫原均能刺激產(chǎn)生S蛋白特異的血清和人IgG(SAB-300/301)�；�于安全性和生產(chǎn)可行性等因素，研究主要圍繞基于SPNV產(chǎn)生的人IgG開展動物和臨床研究。

 

上圖：基于轉(zhuǎn)基因牛的免疫過程。下圖：利用Anti-Spike抗體檢測所得血清（左）和純化人IgG（右）的有效含量。圖片源自參考資料3。

 

除了特異性檢測外，研究利用免疫熒光成像技術(shù)，結(jié)合Anti-Spike抗體來衡量免疫所得血清和抗體的抗病毒中和作用(FRNA50)。相較于只能完成一輪感染的假病毒體系，F(xiàn)RNA50能直觀、全面地反映藥物處理對于病毒感染能力的影響。在該研究中，此法還結(jié)合mRNA檢測驗證病毒的滅活效果，確保疫苗的安全性。結(jié)合FRNA50和傳統(tǒng)的半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(Tissue culture infectious dose-50%,TCID50)測定法，研究證明純化的血清含有高水平的中和多抗。在過表達DPP4的小鼠模型上，無論是預(yù)防性還是治療性給藥，SAB-301都能有效的控制肺部的病毒量。在安全性上，SAB-301不支持抗體依賴的病毒感染增強作用(Antibody-dependent enhancement,ADE)。目前，由SAB Biotherapeutics公司推出的SAB-301已進入一期臨床試驗。

 

利用FRNA50檢測所得血清（左）和純化人IgG（右）靶向MERS病毒的中和能力。FRNA50基于Operetta高內(nèi)涵平臺和配套微孔板。圖片源自參考資料3。

 

No.3利用ADCC抗擊H7N9禽流感的單抗研究

 

作為腫瘤免疫療法的主要推動者，單克隆抗體（單抗）也被廣泛用于抗擊SARS和HIV等多種病毒的研究中。此外，基于HIV-1和流感中和單抗的研究也為疫苗設(shè)計提供了新的思路。但是，基于雜交瘤技術(shù)的傳統(tǒng)單抗制備面臨著耗時長，步驟多且繁瑣等問題，限制了其對可能出現(xiàn)的新型疫情爆發(fā)的應(yīng)對能力。相比下，噬菌體展示技術(shù)為快讀獲得高親和力人源單抗提供了新的途徑�；�于該技術(shù)平臺，復(fù)旦大學(xué)研究人員建立超大型天然全人源抗體庫，并成功鑒定靶向MERS和流感的強力抗體[5,6]。

 

 

在抗擊H7N9流感的工作中，為了獲得低突變的高特異抗體，研究人員以重組表達的HA和HA1蛋白為抗原，基于健康人B細胞來源的天然抗體庫開展多輪篩選，獲得單抗m826。經(jīng)序列分析，研究人員證明m826與胚系基因高度同源，是胚系抗體。相較于體細胞高度突變的抗體，胚系抗體建立時間短，安全性高且成藥性更好，適用于靶向急性感染的抗體和疫苗研發(fā)。

 

基于噬菌體展示技術(shù)的H7N9抗體篩選，圖片源自參考資料6。

 

非常有意思的是，在紅細胞凝集抑制 (Hemagglutination inhibition,HI)反應(yīng)中，m826僅表現(xiàn)出微弱的抗病毒能力。進一步的細胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE)檢測和免疫熒光法中和實驗證明m826不能中和流感病毒，抑制其在靶細胞的增殖。利用親脂性熒光染料R18和SP-DiOC18（3）來標記病毒，研究發(fā)現(xiàn)m826對病毒與靶細胞的結(jié)合和膜融合過程無顯著影響。但是，m826能很強結(jié)合表達H7N9 HA蛋白的細胞，是ADCC（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用）活力的強力介導(dǎo)者。同時，由于不能中和H7N9病毒，m826還能成為高價值的工具性抗體。在動物模型上，IgG1 m826能有效的預(yù)防和控制H7N9的感染。因此，m826依賴于ADCC，而不是中和能力抗擊流感病毒。這一發(fā)現(xiàn)為抗病毒抗體的篩選和研發(fā)提供了新的思路和途徑。

 

左圖：基于免疫熒光成像技術(shù)（熒光標記病毒）的中和實驗，H7N4抗體為中和陽性對照。右上：病毒結(jié)合檢測，紅色熒光探針R18標記病毒，感染30分鐘后進行成像檢測。NA為結(jié)合陰性對照；m336為陰性對照抗體。右下：利用熒光探針R18和SP-DiOC18（3）雙標記病毒，病毒膜融合發(fā)生會誘導(dǎo)SP-DiOC18（3）綠色熒光信號加強。Baf A1為融合陰性對照。上述高通量成像檢測均基于Opera或Operetta高內(nèi)涵平臺。圖片源自參考資料6。

 

No.4靶向膜融合的廣譜抗病毒多肽研究

 

作為動物來源的病毒，冠狀病毒因其多樣性，較高的傳播能力和進化能力限制了單一的靶向療法的臨床應(yīng)用。因此，從長遠角度來看，能作用于多種冠狀病毒的新型廣譜抗病毒藥物，會成為抗擊流行性和新型冠狀病毒感染的終極武器。相較于高度變異的受體結(jié)合區(qū)(Receptor-binding domain, RBD)，病毒膜融合涉及的Heptad repeat (HR)區(qū)高度保守。同時膜融合也是病毒感染和復(fù)制重要的功能性過程。因此，該區(qū)域成為了抑制性多肽的研究重點。靶向冠狀病毒的膜融合過程，來自于復(fù)旦大學(xué)的研究團隊研發(fā)出廣譜多肽抑制劑EK1，為抗擊冠狀病毒和類似病毒提供了新的大分子治療策略[7]。

 

 

冠狀病毒可通過胞內(nèi)體膜融合途徑(Endosomal pathway)或/和細胞表面胞漿膜融合途徑(Non-endosomal pathway)進入細胞。病毒通過結(jié)合宿主細胞受體激活其S2亞基的HR1和HR2區(qū)，互相結(jié)合形成對膜融合至關(guān)重要的6-HB(Six-helix bundle)結(jié)構(gòu)。

 

冠狀病毒的膜融合過程和競爭性多肽工作機制，圖片源自參考資料7。

 

鑒于此，研究人員以多種冠狀病毒的保守HR區(qū)為模板，合成HR1和HR2區(qū)來源的多肽（HR1P和HR2P）用于競爭。通過過表達技術(shù)，研究進一步建立靶向多種冠狀病毒的細胞細胞融合實驗，系統(tǒng)性篩查HR1P和HR2P對細胞融合的抑制。結(jié)果顯示由OC43株來源的HR2P具有廣譜且強效的抑制融合能力。在此基礎(chǔ)上，研究人員通過引入氨基酸和突變等方法，進一步優(yōu)化多肽的可溶性和成藥性。所獲得的多肽EK1，在進一步的一系列體外檢測，包括細胞細胞融合實驗，假病毒法，Blam-Vpr法和活病毒增殖能力檢測中，都表現(xiàn)出強效的廣譜抗病毒能力。

 

細胞細胞融合實驗，過表達病毒S蛋白并帶有GFP信號的293T細胞為作用細胞，Huh-7為靶細胞，圖片源自參考資料7。

 

除了可以用于免疫缺陷和老年患者外，多肽類藥物的另一優(yōu)勢是支持非侵入性鼻腔給藥，適合用于靶向呼吸道的病毒感染。因此，檢測鼻腔給藥下的EK1的體內(nèi)分布非常重要�；�于活體成像技術(shù)，研究觀察到Cy5熒光標記的EK1可廣泛分布于整個呼吸道中，并集中在肺部。此外，一些肺外的器官，包括肝臟、腎和脾，都能檢測到EK1的分布，表明EK1可以進入血液循環(huán)系統(tǒng)和其他臟器中。因此，EK1還可能作用于由冠狀病毒導(dǎo)致的系統(tǒng)性或多器官感染。在OC43和MERS感染小鼠模型上，EK1均表現(xiàn)出強力的抗病毒能力，有效抑制了因感染帶來的體重減輕和死亡現(xiàn)象。從體外到體內(nèi)的多方面安全性評價表明通過鼻腔給藥的EK1是低免疫原性，安全的治療策略。因此，EK1是一個新型、有潛力的廣譜抗冠狀病毒藥物，值得進一步的深入研究。

 

上：基于活體成像檢測鼻腔給藥下Cy5標記的EK1在小鼠體內(nèi)的分布；小動物活體成像檢測基于IVIS平臺。下：EK1處理對模型鼠死亡率、體重和病毒滴度的影響，圖片源自參考資料7。

 

總結(jié)

 

通過上述四個案例，我們總體介紹了靶向病毒段的大分子療法的研究流程和關(guān)注點。助力此類治療方法的研發(fā)，珀金埃爾默提供成熟的整體應(yīng)用解決方案。針對攜帶螢火蟲報告基因的假病毒研究，我們提供全面、配套的涵蓋化學(xué)發(fā)光試劑，微孔板和高通量檢測平臺的解決方案。對于基于慢病毒包裝系統(tǒng)的假病毒，我們還可以提供p24檢測解決方案，用于快速衡量病毒的感染能力。此外，基于成像平臺的解決方案，我們還可以分析短程和長程的復(fù)雜亞細胞活動，例如由病毒介導(dǎo)的膜融合過程。在血清和抗體的篩查和分析中，強大的高內(nèi)涵解決方案能最大程度發(fā)揮表型篩選的優(yōu)勢，發(fā)現(xiàn)具有中和能力、安全的潛在抗體。同時，ADCC，作為關(guān)鍵的抗感染抗體工作機制之一，也是我們的主要應(yīng)用關(guān)注點。針對ADCC的檢測，我們提供金標準、靈活的放射和非放射解決方案，助力抗體類藥物的深入評價[8]。最后，在臨床前動物研究中，除了中和檢測外，我們提供覆蓋功能到結(jié)構(gòu)的活體成像解決方案，助力病理檢測、藥物分析和藥效評價等核心工作。

 

參考文獻

 

1. 藥物機制解讀 | “人民的希望”抗病毒藥物瑞德西韋(Remdesivir)https://mp.weixin.qq.com/s/MyJO1XjkD6uQAgsoMFTxEw

2. Wang L, et al. Evaluation of candidate vaccine approaches for MERS-CoV. Nat Commun. 2015 Jul 28;6:7712.

3. Luke T, et al. Human polyclonal immunoglobulin G from transchromosomic bovines inhibits MERS-CoV in vivo. Sci Transl Med. 2016 Feb 17;8（326）:326ra21.

4. Thomas Luke, et al. Fully Human Immunoglobulin G From Transchromosomic Bovines Treats Nonhuman Primates Infected With Ebola Virus Makona Isolate. J Infect Dis. 2018 Dec 15; 218（Suppl 5）: S636–S648.

5. Ying T, et al. Junctional and allele-specific residues are critical for MERS-CoV neutralization by an exceptionally potent germline-like antibody. Nat Commun. 2015 Sep 15;6:8223.

6. Fei Yu,et al. A potent germline-like human monoclonal antibody targets a pH-sensitive epitope on H7N9 influenza hemagglutinin. Cell Host Microbe. 2017 Oct 11; 22（4）: 471–483.e5.

7. Shuai Xia,et al. A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike. Sci Adv. 2019 Apr; 5（4）: eaav4580

8. DELFIA經(jīng)典技術(shù)應(yīng)用于單抗研發(fā)及細胞治療——AD0116細胞殺傷專題之ADCChttps://mp.weixin.qq.com/s/0lkBdDHL5MFIyoeoFV4wWQ