納米微粒（NPs）在治療性乙肝疫苗開發(fā)與揭示免疫學(xué)新機制的應(yīng)用

乙型肝炎病毒（HBV）感染是世界范圍內(nèi)最常見的慢性病毒感染，與肝硬化及肝癌的關(guān)系密切，是全球性重大公共衛(wèi)生健康問題之一。盡管開發(fā)了針對HBV的預(yù)防性疫苗，但是誘導(dǎo)有效抗體應(yīng)答的治療性免疫仍然存在困難。

納米微粒（NPs）可以作為各種類型物質(zhì)的保護性遞送載體，增加物質(zhì)的穩(wěn)定性和溶解性，延長半衰期，同時納米微粒還可以靶向癌細(xì)胞免疫系統(tǒng)，識別納米和微米大小的顆粒（比如病毒和細(xì)菌），并對它們做出反應(yīng)。在材料科學(xué)與生命科學(xué)飛速發(fā)展的今天，納米材料應(yīng)用于疫苗的開發(fā)，癌癥的治療等方面有著廣闊的前景。

HBV表面蛋白preS1結(jié)構(gòu)域是肝細(xì)胞上主要的病毒附著位點，為抗病毒治療提供了靶點，但是，其免疫原性差限制了臨床轉(zhuǎn)化。近期，中國科學(xué)院生物物理研究所感染與免疫重點實驗室朱明昭課題組在Nature Nanotechnology（IF：33.407）上發(fā)表了題為“Dual-targeting nanoparticle vaccine elicits a therapeutic antibody response against chronic hepatitis B”的文章，報道了一種效果顯著、具有臨床轉(zhuǎn)化潛力的治療性乙肝疫苗，而且揭示了納米顆粒抗原靶向遞送、轉(zhuǎn)運、誘導(dǎo)Tfh和B細(xì)胞活化應(yīng)答的免疫學(xué)新機制，具有重要的免疫學(xué)理論價值和醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。

常規(guī)的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）疫苗在大多數(shù)健康的接種人群中誘導(dǎo)產(chǎn)生保護性抗體，并有效降低了新的HBV感染的發(fā)生率。但是，HBsAg在慢性乙型肝炎（CHB）臨床前動物模型或患者中均無法誘導(dǎo)有效的抗體應(yīng)答，這可能是由于病毒抗原長期誘導(dǎo)的抗原特異性免疫耐受。因此，迫切需要一種有效根除乙肝的治療策略。與HBsAg相比，HBV表面抗原的preS1結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是開發(fā)治療性疫苗的理想免疫原候選物。在CHB患者中，對preS1似乎比對HBsAg的免疫耐受性低得多。實際上，作者的研究顯示，preS1疫苗（而不是HBsAg疫苗）接種可以誘導(dǎo)攜帶HBV的小鼠產(chǎn)生中和性抗體。但是，與HBsAg相比，preS1似乎不是有效的抗體誘導(dǎo)劑。因此，如何提高preS1的免疫原性以增強治療性抗體反應(yīng)是當(dāng)前基于preS1開發(fā)治療性疫苗的關(guān)鍵問題。

淋巴結(jié)（LN）抗原呈遞細(xì)胞（APC）靶向治療已被普遍認(rèn)為是許多納米疫苗的重要特征。然而，考慮到APC的復(fù)雜組成和不同APC亞型的多樣化功能，納米疫苗免疫過程中不同APC亞型的特定作用以及如何協(xié)調(diào)靶向它們以進行有效的適應(yīng)性免疫反應(yīng)尚不清楚。鐵蛋白自組裝NPs最近在疫苗設(shè)計中得到了廣泛的認(rèn)可。但是，其潛在的免疫學(xué)機制仍未完全闡明。在該研究中，實驗團隊設(shè)計了鐵蛋白NP-preS1疫苗。

●評估疫苗的免疫原性和生物安全性 ●

首先，他們對這種疫苗的免疫原性及安全性進行了評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第21天，鐵蛋白NP-preS1疫苗誘導(dǎo)的抗體水平是可溶性SC-preS1的50倍。鐵蛋白NP-preS1免疫組中的抗preS1水平增加，并在第60天達到峰值，此時測得的抗體水平約是SC-preS1對照疫苗組的150倍，此時抗體水平仍然保持低位。抗體反應(yīng)逐漸下降，但在第235天仍可檢測到。此外，與SC-preS1對照組相比，加強免疫在鐵蛋白NP-preS1組中引起了更強的抗體反應(yīng)（約600倍）。此外，將preS1抗原與鐵蛋白NP物理混合而不是共價結(jié)合不能引起強烈的抗preS1反應(yīng)，這表明在鐵蛋白NP上展示抗原的必要性。因此，與鐵蛋白NPs結(jié)合的preS1通常增強preS1抗原的免疫原性并引發(fā)有效的抗體反應(yīng)。進一步的研究表明，鐵蛋白NP-preS1疫苗誘導(dǎo)的抗preS1抗體比SC-preS1誘導(dǎo)的抗體具有更高的親和力。從安全性的角度來看，盡管很容易誘導(dǎo)抗激烈熱球菌（Pf）—鐵蛋白的強烈反應(yīng)，但在免疫Pf鐵蛋白NP-preS1后沒有誘導(dǎo)出針對小鼠鐵蛋白的交叉反應(yīng)抗體。另外，谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酰草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶的血清水平都正常。鐵蛋白NPs的最低鐵含量不太可能影響體內(nèi)鐵的穩(wěn)態(tài)。綜上所述，基于鐵蛋白-NP的preS1疫苗具有顯著的免疫原性和生物安全性。

圖1. 鐵蛋白NP疫苗的分子設(shè)計及其誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)

●評估疫苗的預(yù)防和治療作用●

為測試鐵蛋白NP-preS1疫苗誘導(dǎo)的preS1抗血清是否可以預(yù)防HBV感染，疫苗接種的小鼠在接種兩周后接受了腺病毒（AAV-HBV1.3）的第二次攻毒。為了評估抗血清的中和能力，在存在不同免疫血清的情況下，用HBV感染HepG2-hNTCP細(xì)胞。結(jié)果，體內(nèi)和體外實驗均表明鐵蛋白NP-preS1疫苗是有效的預(yù)防性疫苗。為確定該疫苗的治療效果，研究人員建立了攜帶HBV的小鼠，并每兩周用等摩爾的鐵蛋白NP-preS1疫苗或SC-preS1免疫四次，結(jié)果顯示NP-preS1的功能性治愈潛力和肝臟中HBV核心抗原的清除并未伴有肝損傷。因此，鐵蛋白-preS1 NPs和CpG在長期HBV感染的小鼠模型中可作為一種有效且非致病的治療性疫苗。此外，該研究表明，鐵蛋白NP-preS1疫苗誘導(dǎo)的Th1反應(yīng)可能在實現(xiàn)治療效果中起重要作用：增強IFN-γ反應(yīng)可能與鐵蛋白NP-preS1疫苗協(xié)同作用。

●免疫機制研究 ●

為了了解鐵蛋白NP疫苗是如何被宿主免疫系統(tǒng)識別和加工的，研究用熒光素酶標(biāo)記的鐵蛋白NP以追蹤其路徑。鐵蛋白NPs似乎主要被淋巴結(jié)中的SIGNR1+DC和SIGNR1+巨噬細(xì)胞捕獲。

生發(fā)中心（GC）的形成對于強烈的抗體反應(yīng)至關(guān)重要，GC B細(xì)胞的親和力取決于CD4+Tfh細(xì)胞。對于顆粒抗原免疫，DCs可以將抗原攜帶到淋巴濾泡以激活B細(xì)胞。盡管DC在T細(xì)胞活化中起主要作用，但在鐵蛋白NP疫苗免疫期間對于早期B細(xì)胞活化并非必要的。除DC外，SIGNR1+巨噬細(xì)胞可有效捕獲鐵蛋白NP，在B細(xì)胞活化早期和IgG應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用。SIGNR1+巨噬細(xì)胞可能直接將抗原帶到淋巴濾泡以激活B細(xì)胞。研究人員想知道這種遷移是如何受到調(diào)控的，由于CXCL13在B細(xì)胞濾泡中的大量表達及其在淋巴濾泡遷移中的作用，就鑒定了CXCL13-CXCR5軸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一種新的免疫機制：CXCR5依賴性的SIGNR1+巨噬細(xì)胞可以攜帶鐵蛋白納米顆�？乖�，向淋巴濾泡遷移，傳遞抗原給B細(xì)胞并激活B細(xì)胞。

圖2. B細(xì)胞激活和抗體產(chǎn)生需要SIGNR1+巨噬細(xì)胞

●小結(jié) ●

作者設(shè)計了一種鐵蛋白納米顆粒疫苗，該疫苗在小鼠模型中顯示出明顯的預(yù)防和治療作用�？梢詫�preS1遞送到特定的髓樣細(xì)胞，包括SIGNR1+樹突狀細(xì)胞（激活T濾泡性輔助細(xì)胞）和淋巴竇相關(guān)的SIGNR1+巨噬細(xì)胞（可以激活B細(xì)胞）。高水平和持久的抗preS1反應(yīng)，可在慢性HBV小鼠模型中有效清除病毒并進行部分血清學(xué)轉(zhuǎn)化，為慢性乙肝的功能治愈提供了新的疫苗接種策略。從機制上講，鐵蛋白NP靶向不同的SIGNR1+APC，以誘導(dǎo)T卵泡輔助（Tfh）細(xì)胞和B細(xì)胞活化，從而提高抗體的產(chǎn)生。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)了一種新的機制：CXCR5依賴性的SIGNR1+巨噬細(xì)胞可以攜帶鐵蛋白納米顆�？乖�，向淋巴濾泡遷移，傳遞抗原給B細(xì)胞并激活B細(xì)胞。針對SIGNR1+常駐DC和LN中的巨噬細(xì)胞，這項研究可能會為將來的CHB治療轉(zhuǎn)化研究提供一個很好的理論支持。