分離病毒及構(gòu)建假病毒在抗疫研究中的應(yīng)用

圖3：由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所的研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊Nature的子刊Nature Communication上發(fā)表 ——《Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entryand its immune cross-reactivity with SARS-CoV》。此項(xiàng)研究構(gòu)建SARS-CoV-2 S蛋白假病毒系統(tǒng)和293T的hACE2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，以此確定SARS-CoV-2的易感細(xì)胞系、病毒受體、侵入途徑和蛋白酶激活，揭示了SARS-CoV-2入侵人體細(xì)胞的具體過程。

圖4：SARS-CoV-2-S假病毒包裝過程，圖片來源醫(yī)麥新觀察丨《新冠病毒株極難獲得，假病毒提供解決方案助力藥物開發(fā)》

假病毒是依據(jù)已公開的序列而制備成一種具有原病毒的基本特點(diǎn)和免疫原性，同時(shí)又不具備致病性，方便實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模使用的替代物。由于其生物安全風(fēng)險(xiǎn)較低（僅要求實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別二級(jí)(BSL-2)），質(zhì)控方法可控，可以長(zhǎng)期穩(wěn)定制備和供應(yīng)。假病毒因其具有“逼真” 、穩(wěn)定、安全等特點(diǎn)，已被廣泛用于研究感染機(jī)制，受體識(shí)別和病毒抑制，以及開發(fā)和評(píng)估抗體和疫苗。

假病毒構(gòu)建通常都依賴于病毒載體系統(tǒng)的重組包裝(圖5)，理想的病毒載體同樣也表現(xiàn)出基因組穩(wěn)定性、細(xì)胞型特異性、有效感染率高、對(duì)受感染細(xì)胞生理機(jī)能影響小，同時(shí)致病性小等特點(diǎn)。借助病毒載體，例如，慢病毒 (Lentivirus)、水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)、腺病毒 (Adenovirus)、腺相關(guān)病毒(Adeno-associated Virus, AAV)將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞并構(gòu)建新的假病毒模型已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究，科學(xué)家已經(jīng)探索了出多種用于創(chuàng)建包膜型假病毒的包裝系統(tǒng)，用于諸如埃博拉病毒(EBOV)，馬爾堡病毒(MARV)和拉沙熱病毒(LASV)等新興傳染病(EID)的研究。

科研人員使用假病毒模擬抗體阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞的生物過程，檢測(cè)抗體或血清對(duì)假病毒是否具有中和活性 (假病毒通常經(jīng)過改造以攜帶熒光素酶報(bào)告基因，使其進(jìn)行定量分析時(shí)比對(duì)野生型病毒容易得多，而且已證明假病毒感染的細(xì)胞數(shù)量與報(bào)告基因表達(dá)成正比)。圖5：假病毒包裝過程 - 將熒光素酶和gp64基因插入VSV的全長(zhǎng)cDNA克隆中（代替G基因命名為ΔG-Luc）。gp64pv和VSVpv是通過將VSVΔG / Luc-* G分別瞬時(shí)感染表達(dá)GP64和VSVG的293T細(xì)胞而產(chǎn)生的。

由于病毒與假病毒顆粒較小，直徑基本在20-300納米之間 （新冠病毒電鏡照片顯示其直徑僅為100納米），低轉(zhuǎn)速、低離心力條件并不能使病毒顆粒充分沉降，須借助超速離心技術(shù)來進(jìn)行病毒顆粒分離。

而病毒載體的分離方式與病毒類似—當(dāng)攜帶目的基因的病毒載體感染培養(yǎng)的細(xì)胞，受感染細(xì)胞生產(chǎn)新的同類病毒，并釋放進(jìn)入培養(yǎng)基中，再將新病毒重新采集并純化。在此過程中產(chǎn)生的病毒載量、純度和質(zhì)量都會(huì)直接影響后續(xù)載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。高效可靠的離心方案同樣有助于優(yōu)化病毒載體純化，例如：在高速和超速離心條件下，能有效地將病毒顆粒從細(xì)胞、細(xì)胞碎片中精細(xì)分離；借助分析性超速離心（AUC） 的流體動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)全方位精準(zhǔn)測(cè)量，則可根據(jù)病毒衣殼密度（一種病毒載量衡量方式），來真實(shí)鑒定區(qū)分完整、含部分遺傳物質(zhì)、空殼病毒載體及其他細(xì)胞雜質(zhì)，提高包裝效率，提供藥用級(jí)別病毒載體顆粒質(zhì)控 。

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參考文獻(xiàn)

1. Xiuyuan Ou et al. Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV. Nat Commun. 2020 Mar 27;11(1):1620. 
2. Yuuki Kaname et al. Acquisition of Complement Resistance through Incorporation of CD55/Decay-Accelerating Factor into Viral Particles Bearing Baculovirus GP64. JOURNAL OF VIROLOGY, Apr. 2010, p. 3210–3219 Vol. 84, No. 7
3. Qianqian Li et al. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology : Vol 28 , No 1

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