超級(jí)多模式基因電轉(zhuǎn)化儀在疫苗研發(fā)方向的應(yīng)用

新型冠狀病毒在國(guó)內(nèi)雖然基本已經(jīng)得到較好的控制，但是疫苗的研發(fā)還處在攻堅(jiān)階段。今天我們解析的這篇文章是來(lái)自于《Molecular Therapy》(IF=6.9) original aticle. 這篇文章中采用日本BEX CUY21 EDIT II活體/細(xì)胞電轉(zhuǎn)化儀，對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行DNA疫苗電轉(zhuǎn)注射，發(fā)現(xiàn)和mRNA疫苗相比，sa-RNA是更好的抗病毒疫苗。


摘要

      目前，某些病原體擴(kuò)散迅速且變異率高，但疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)有時(shí)候跟不上速度，不能更快更準(zhǔn)的控制病原體的侵襲與擴(kuò)散，隨之帶來(lái)的嚴(yán)重后果不敢想象。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的疫苗種類去緩解這狀況。RNA疫苗一直倍受歡迎, 源于其安全，生產(chǎn)無(wú)需細(xì)胞，可以快速對(duì)病原體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。

 目前有兩種RNA疫苗種類：

1． 合成mRNA，其僅編碼目標(biāo)抗原。

2． 自擴(kuò)增RNA（sa-RNA），是病毒衍生的RNA，編碼目標(biāo)抗原和使RNA疫苗復(fù)制的蛋白質(zhì)。

     目前為止的研究表明：兩種疫苗類型均可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，但并未明確哪種方法是最佳的。因此，本研究比較了一下合成mRNA和sa-RNA表達(dá)的流感病病毒血凝素。發(fā)現(xiàn)兩種RNA都有保護(hù)性。但同等的保護(hù)水平，sa-RNA 僅需要1.25 mg，而mRNA 需要80 mg，足足節(jié)省了64倍的原料。確定sa-RNA比mRNA更有效后，又以sa-RNA作為疫苗測(cè)試了三株流感病毒，分別為H1N1，H3N2（X31）和B（馬薩諸塞州）毒株，并且發(fā)現(xiàn)sa-RNA都能保護(hù)目標(biāo)免受感染。當(dāng)sa-RNA制成三價(jià)制劑，可以防止H1N1和H3N2病毒侵染。由此我們得出結(jié)論：sa-RNA更具美好前景的抗病毒疫苗。

 

背景介紹

      流感病毒是一種具有大流行潛力的病原體，屬于正粘病毒科，可分為3種型：A，B和C型流感。由于它們的RNA基因組是分段的，因此有許多亞型，尤其是在A型流感病毒中。發(fā)生不同病毒亞型的突變和重組相當(dāng)容易導(dǎo)致新菌株的頻繁出現(xiàn)。在人類中，流感病毒在20世紀(jì)引起了3次大流行。2009年最新的“豬流感”大流行被認(rèn)為是低致病性毒株，但仍然感染了約2億人，并造成了201,200人死亡。目前，大多數(shù)流感疫苗是由滅活疫苗制備的病毒，生長(zhǎng)在有胚的雞蛋中，但這對(duì)于禽類病毒，可能對(duì)雞胚有高致病性。從這方面來(lái)說(shuō)，RNA疫苗更有效率。mRNA已用于免疫小鼠，雪貂和豬，獲得其流感疫苗。2013年，sa-RNA已用于防治H1N1和新興的H7N9亞型流感病毒。

    因?yàn)椴≡�體序列數(shù)據(jù)采集的速度較快，所以核酸疫苗是較有前景的疫苗種類。此外，與滅活或減毒病毒相比，核酸是不變的基本產(chǎn)物，所需的監(jiān)管測(cè)試更少。目前已經(jīng)提出了兩種核酸疫苗種類用于疫苗接種，即RNA和DNA。相對(duì)來(lái)說(shuō)，RNA是較好的，因?yàn)榕cDNA疫苗（必須克服兩個(gè)轉(zhuǎn)錄障礙，即細(xì)胞膜和核膜）不同，RNA疫苗一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)就可以將其轉(zhuǎn)化為抗原，這不但提高了轉(zhuǎn)染效率，而且使免疫應(yīng)答具有連鎖反應(yīng)。RNA疫苗快速與安全，生產(chǎn)過(guò)程無(wú)需細(xì)胞，且能誘導(dǎo)B細(xì)胞和T細(xì)胞反應(yīng)，優(yōu)點(diǎn)明顯。雖然合成mRNA可立即翻譯抗原，有良好的抗病毒保護(hù)作用，但其合成需要大量的mRNA原料。從小型動(dòng)物所需的材料擴(kuò)大到人類，可能會(huì)在出現(xiàn)流行病時(shí)限制疫苗的使用。因此，需要對(duì)該方法進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

 

BEX CUY21 EDIT II在此研究中的作用

最新款的CUY21 EDIT II 采用最先進(jìn)的脈沖芯片控制技術(shù)，BEX獨(dú)有的多步脈沖，反向脈沖及恒流脈沖轉(zhuǎn)化模式，無(wú)需任何專用試劑，提供高效高存活率的轉(zhuǎn)化。

      本研究中，為了驗(yàn)證DNA疫苗是否可預(yù)防H1N1流感，所以對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行DNA疫苗電轉(zhuǎn)注射，采用150v穿孔電壓，5個(gè)正負(fù)交替極性脈沖。

 

 

結(jié)果

1.少劑量的sa-RNA即可與mRNA等效。

A/B：用120，80，20ug H1N1/PR8 HA-mRNA 及5ug滅活病毒（def-Virus）和乳酸林格緩沖液對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行肌肉注射，三周后再進(jìn)行一次增強(qiáng)免疫。然后通過(guò)HAI（A）和VNT（B）對(duì)其體內(nèi)H1N1特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。

 C/D：BALB/c小鼠通過(guò)鼻內(nèi)感染10倍劑量的H1N1/PR8 HA-mRNA，其生存率（C）與體重變化（D）。

 E/F：用1.25，0.25，0.05ug H1N1/PR8 HA-SaRNA 及5ug滅活病毒（def-Virus）和乳酸林格緩沖液對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行肌肉注射，三周后再進(jìn)行一次增強(qiáng)。然后通過(guò)HAI（E）和VNT（F）對(duì)其體內(nèi)H1N1特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。

 G/H：BALB/c小鼠通過(guò)鼻內(nèi)感染10倍劑量的H1N1/PR8 HA-SaRNA，其生存率（C）與體重變化（D）。

 

2.Sa-RNA與mRNA應(yīng)答反應(yīng)的對(duì)比

 

3.與mRNA相比，sa-RNA可以表達(dá)更多抗原。

A：BALB/c小鼠通過(guò)肌肉注射4ug（每條腿2ug）帶有螢光素酶基因的Sa-RNA和mRNA。在接種后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行腹膜內(nèi)注射D-熒光素，使用IVIS光譜體內(nèi)成像系統(tǒng)觀察表達(dá)情況。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選擇一張代表性圖像。 

B：來(lái)自n = 6只動(dòng)物的熒光素酶水平情況，點(diǎn)代表平均值±SEM。

 

4.sa-RNA的效率可以通過(guò)改變其運(yùn)輸方式進(jìn)而提升，如聚乙烯亞胺運(yùn)輸方式（PEI-based）。

A/B：BALB-c小鼠分別用PEI-Sa RNA和僅Sa-RNA在第一天與第21天注射。在第19天（A）與54天（B）收集血清。
 

5.編碼A型流感病毒的sa-RNA疫苗可預(yù)防目前的季節(jié)性流感毒株。

A-F：BALB-c小鼠肌肉注射1.5ug和0.5ug Cal‘09 H1N1 HA-Sa RNA。

G-I：BALB-c小鼠肌肉注射1.5ug和0.5ug B-Mass H1N1 HA-Sa RNA。

J-L：BALB-c小鼠肌肉注射1.5ug和0.5ug X31 H3N2 H1N1 HA-Sa RNA。免疫應(yīng)答反應(yīng)結(jié)果與1.5ug HIV Sa-RNA（陰性對(duì)照），蛋白質(zhì)疫苗和無(wú)進(jìn)行免疫的小鼠作對(duì)比。

A：接種疫苗后測(cè)量H1N1特異性IgG。

B：小鼠鼻內(nèi)感染了Cal’09 H1N1病毒后的體重變化。

C：測(cè)量肺中H1N1 流感M基因拷貝數(shù)。

D/E：H1N1特異性IgG與特異性IgG2a/IgG1的測(cè)量情況。

F：肺中特異性H1 CD8+T細(xì)胞在感染后第7天的測(cè)量情況。

G：對(duì)于B-Mass，特異性IgG用ELISA方法檢測(cè)。

H：小鼠鼻內(nèi)感染了B/Florida/06病毒后的體重變化。

I：流感病毒B NS基因肺中的拷貝數(shù)測(cè)量情況。

J：H3N2特異性Ig ELISA測(cè)量情況。

K：小鼠鼻內(nèi)感染了X31 H3N2病毒后的體重變化。

L：測(cè)量肺中流感X31 H3N2 M基因拷貝數(shù)。

 

6.與單一HA相比，結(jié)合三種HA的sa-RNA（三價(jià)Sa-RNA）不會(huì)降低對(duì)H1NI 和H3N2的抵抗作用。

 

A-C：BALB/c小鼠肌肉分別注射1.5ug Cal’09 H1N1，B-Mass和X31 H3N2 Sa-RNA（三價(jià)Sa-RNA），僅1.5ug Cal’09 H1N1和1.8ug流感病毒蛋白疫苗，三周后進(jìn)行一次增強(qiáng)免疫。

A：特異性H1N1 IgG抗體的ELISA檢測(cè)情況。

B：特異性H3N2 IgG抗體的ELISA檢測(cè)情況。

C：特異性B IgG抗體的ELISA檢測(cè)情況。

D：在第7周，小鼠感染Cal’09 H1N1流感病毒，并且每天監(jiān)測(cè)體重變化結(jié)果。

E：7天后，三價(jià)Sa-RNA實(shí)驗(yàn)組與僅Cal’09 H1N1實(shí)驗(yàn)組感染X31 H3N2流感病毒后體重變化結(jié)果。

 

7.單劑量的sa-RNA或DNA疫苗可預(yù)防H1N1流感

A：BALB/c小鼠肌肉注射1.5ug Cal’09 H1N1 DNA或Sa-RNA疫苗。RNA注射是帶運(yùn)輸方式的形式，DNA注射是帶運(yùn)輸方式的形式或僅DNA形式，通過(guò)肌肉電轉(zhuǎn)注射。4周后，感染Cal‘09 H1N1流感病毒，對(duì)其體重情況進(jìn)行測(cè)量。

B：感染后7天，測(cè)量肺中M基因拷貝數(shù)。

C：感染后4天，特異性H1N1 IgG 測(cè)量。

D：特異性IgG2a/IgG1的測(cè)量情況。

E：感染后7天，通過(guò)五聚體染色法在肺組織中測(cè)量流感病毒特異性CD8 + T細(xì)胞的比例。

 

結(jié)論

     

本研究比較合成mRNA和sa-RNA表達(dá)的流感病病毒血凝素。發(fā)現(xiàn)兩種RNA都有保護(hù)性的。但同等的保護(hù)水平，sa-RNA 僅需要1.25 mg，而mRNA 需要80 mg，足足節(jié)省了64倍的原料。確定sa-RNA比mRNA更有效后，本實(shí)驗(yàn)以sa-RNA作為疫苗測(cè)試了三株流感病毒，分別為H1N1，H3N2（X31）和B（馬薩諸塞州）毒株，并且發(fā)現(xiàn)sa-RNA都能保護(hù)目標(biāo)免受感染。當(dāng)sa-RNA制成三價(jià)制劑，可以防止H1N1和H3N2病毒侵染。由此我們得出結(jié)論：sa-RNA是有美好前景的抗病毒疫苗。

 

 

參考文獻(xiàn)

PMID: 29275847

PMCID: PMC5835025

DOI: 10.1016/j.ymthe.2017.11.017

 

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