磁珠與瓊脂糖珠在免疫沉淀實驗使用中的區(qū)別
長久以來，多孔的瓊脂糖珠 (也稱瓊脂糖樹脂) 作為免疫沉淀實驗中的固相支持物常用的材料。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu) (直徑 50-150 μm) 可以結(jié)合抗體 (繼而結(jié)合靶蛋白) ，它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體，而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。
圖 1. 瓊脂糖珠
在無需抗體飽和的情況下，瓊脂糖珠能很好的結(jié)合極大量目的蛋白。但值得注意的是，在免疫沉淀實驗中，抗體的量常常不足以滿足瓊脂糖珠的飽和荷載量，沒有被抗體覆蓋的瓊脂糖珠的部分則可以自由地結(jié)合任何可粘附的物質(zhì)，這種非特異性結(jié)合升高引起背景信號升高，這時，“高荷載量優(yōu)勢”會變成“高荷載量劣勢”。對裂解樣本進行預(yù)處理操作，是去除非特異性結(jié)合物最為簡單有效的方法。
■ 預(yù)處理
裂解樣本是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和核酸的混合物，與抗體、蛋白 A/G、微珠材料會發(fā)生非特異性結(jié)合，從而對免疫沉淀結(jié)果造成影響。主要方法有兩種：
a. 排除由于微珠本身材質(zhì)引起的非特異性結(jié)合：將裂解樣本與微珠單獨混合孵育，隨后去除微珠并收集上清液，再進行免疫沉淀實驗。
b. 排除由細胞成分引起的非特異性結(jié)合：使用相同抗體亞型類別但不靶向目的蛋白的抗體，在相同的組分條件中與裂解樣本混合孵育，再進行免疫沉淀實驗。
磁珠
目前，超順磁性微珠已經(jīng)大幅取代瓊脂糖珠，成為免疫沉淀和其他微量親和純化方法的首先選擇。
與瓊脂糖珠不同，磁珠是固體，抗體的結(jié)合僅限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ，盡管磁珠沒有多孔中心增加結(jié)合能力，但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多，使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。
磁珠 VS 瓊脂糖珠
| Magnetic Beads | Agarose Beads | |
| Capacity | ++ | +++ |
| Yield |
+++ |
++ |
| Reproducibility | +++ | ++ |
| Purity-Specificity | +++ | + |
| Easy of Use | ++++ | + |
| Speed | ++++ | + |
| Multiple Samples | +++ | + |
| Automation | +++ | - |
■ 結(jié)合能力
由于瓊脂糖珠直徑較大且具有海綿狀結(jié)構(gòu)，因而比磁珠有更大的表面積和更大的結(jié)合能力。但是瓊脂糖珠的可變多孔徑會使抗體會落入孔內(nèi)，導(dǎo)致結(jié)合受限，尤其是超大蛋白 (一般是蛋白復(fù)合物) 的結(jié)合，并且抗體可能會在洗滌步驟 (離心) 中流失。 相反，綁定在磁珠表面的抗體均能與目的蛋白結(jié)合，并且抗體很少會在溫和的洗滌步驟 (磁性分離) 中流失。
另外，瓊脂糖珠的非特異性結(jié)合能力大于磁珠。 瓊脂糖珠的非特異性結(jié)合不限于其表面抗體結(jié)合位點，抗體的任何表面或參加免疫沉淀反應(yīng)的成分均可與樣品中非目的蛋白成分結(jié)合，即使使用完全飽和的珠子，仍會發(fā)生非特異性結(jié)合。因此，進行免疫沉淀之前預(yù)處理樣品極為重要。
■ 成本
免疫沉淀中設(shè)計微珠的成本主要取決于免疫沉淀方法和每個免疫沉淀反應(yīng)所需要的微珠量。
瓊脂糖珠：瓊脂糖珠必須通過離心濃縮在管底部，并在每次孵育和洗滌除去上清液，通常需要肉眼識別管底部的瓊脂糖珠，因此，每個免疫沉淀實驗至少需要使用 25-50 μL 的瓊脂糖珠。
磁珠：采用磁性分離，無需設(shè)定最小體積的的磁珠使用量，用量僅取決于目的蛋白和免疫沉淀抗體。
當(dāng)然，在使用瓊脂糖珠的過程中，可以使用過濾離心柱代替普通的微量離心管，該離心柱包含一個過濾器，允許通過短暫的離心使除珠子外的所有免疫沉淀成分流過，因此可以顯著減少每個反應(yīng)所需的瓊脂糖珠使用量。
■ 簡單快速
由于瓊脂糖珠免疫沉淀需要較長的孵育時間，預(yù)處理步驟和多次離心，所以其需要大量的手動操作，總時間為 1-1.5 小時。相反，磁珠免疫沉淀反應(yīng)不需要離心，配合使用磁性分離架磁性分離，在 30 分鐘內(nèi)即可完成實驗，因此可以在較短時間內(nèi)輕松處理并獲得較多樣本的分析數(shù)據(jù)。
■ 自動化
磁珠操作簡便，因此可以使用自動化免疫沉淀設(shè)備，不僅節(jié)省了工作量和時間，還可以應(yīng)用于高通量。
總結(jié)
當(dāng)樣品體積< 2 mL，建議使用磁珠 。在日常小型分離特定蛋白質(zhì)和蛋白復(fù)合物時，以及進行手動和自動化標(biāo)準(zhǔn) IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP 和 Pull-down 反應(yīng)并立即用于后續(xù)檢測分析時，磁珠是最佳選擇。
當(dāng)樣品體積> 2 mL，建議使用瓊脂糖珠 。 當(dāng)抗體成本較低并且想要純化大量目的蛋白用于多種下游分析時，瓊脂糖珠是最佳選擇。
