如何利用新型固定床生物反應器開發(fā)高產量活病毒疫苗生產平臺

​摘要：病毒疫苗生產日益增加的重要性，推動了細胞高密度培養(yǎng)生產工藝的發(fā)展。傳統(tǒng)的細胞貼壁培養(yǎng)工藝有一定的物理局限性，如較大的設備占地、時間和較多的勞動力。我們通過新型一次性scale-Xcarbo生物反應器建立的病毒疫苗生產系統(tǒng)，解決了這種限制。該單元結構緊湊，且可規(guī)模放大，并且可實現與生物感應器罐連接進行連續(xù)的下游純化及濃縮工藝。Vero細胞是病毒疫苗生產中使用最多的貼壁細胞系之一。本文中使用Vero細胞專利細胞系進行含拉沙熱病毒糖蛋白的活性重組水泡口炎病毒疫苗生產。本文中，進行了代謝物分析，并比較了傳統(tǒng)搖瓶、細胞工廠以及scale-Xcarbo生物反應器的病毒產量。相比傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)瓶的2.67x10⁶ pfu/cm²以及細胞工廠的5.77x10⁸pfu/cm²，一次性使用生物反應器單位面積可生產高2-4 log的滴度，約為5x10¹⁰ pfu/cm²。該新型生物反應器平臺，可實現經濟高效和可規(guī)模放大的病毒疫苗生產。

1. 簡介

一次性使用的固定床生物反應器作為貼壁細胞培養(yǎng)平臺，可用于多種不同病毒載體、活病毒及基于病毒的疫苗的生產。此類生物反應器將平底器皿系統(tǒng)的低剪切環(huán)境和自動化及可放大性相結合。Pall的iCELLis^®和Eppendorf的Fibra-Cel^®系統(tǒng)已被用于病毒載體和活病毒的高產量生產。使用這種封閉式固定床生物反應器具有顯著的優(yōu)勢，包括產品控制、較低的資源和材料需求、節(jié)省生產時間以及更低的單位劑量生產成本。最近上市的固定床產品是來自Univercells的scale-X 生物反應器系統(tǒng)。scale-X產品線提供一系列的生長表面積規(guī)格：scale-X hydro（<3m²）、carbo（10-30m²）、以及nitro（200-600m²）。該范圍可實現用于臨床批次生產的可放大工藝和產能。在Univercells產品線中，生物反應器高度增加，而直徑保持恒定。例如，carbo 10m²生物反應器高度為30m²生物反應器的1/3。而不同產品線之間的規(guī)模放大通過保持固定床高度恒定而增加直徑來實現。例如，200m²生物反應器與10m²生物反應器具有相同的高度，但是直徑不同。

scale-X carbo系統(tǒng)為一次性使用生物反應器，其偶聯了以實驗室規(guī)模自動化工藝控制器（pH、DO、T、攪拌、液體流速）操作的在線產物濃縮模塊，可實現病毒產物的生產及同步濃縮；這是將這種固定床生物反應器與市面上其它產品區(qū)別開來的新特點。scale-X carbo生物反應器中的固定床可為細胞生長提供10至30m2的表面積（生長面積相當于120-360個滾甁、59-175個HYPERFlasks^®、16-48個CellSTACK^®-10層或6-16個HYPERStack^®-36層罐），根據表面積規(guī)格，罐總體積為1.6-3.2L。這可有助于獲得更高的單位體積細胞密度以及緊湊的占地，從而整合在標準的生物安全柜內。

大多數商品化固定床生物反應器使用隨機裝填的圓盤或織物條，作為細胞貼附的底物；而scale-X生物反應器使用以篩網層組織的固定床，其可為細胞生長提供所需均勻性以及罐與罐之間的一致性。固定床由5cm2寬度的剛性聚丙烯篩網條帶和非編織親水性聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）織物交替螺旋管式組成，前者用于結構定型和培養(yǎng)基流動，后者用于細胞截留和貼附。這可實現均質的徑向和垂直細胞分布以及通過篩網層的線性培養(yǎng)基流動，確保均勻的營養(yǎng)物質供應。取樣端口安裝在生物反應器頂蓋內，可通過手動操作，監(jiān)測培養(yǎng)過程中的細胞生長。該功能為細胞計數樣品獲取提供了一個快速且便利的接入點，避免罐內的交叉污染風險。通過將受控的混合氣體供應至生物反應器的頂部空間（氧氣供應、CO₂脫氣），并允許通過下降膜液氣界面吸收，實現環(huán)境控制，以支持細胞生長。

該生物反應器另一個與眾不同的特點是在線中空纖維過濾器的使用，其可在生產階段或收獲時濃縮生產的產物。含有病毒的培養(yǎng)基灌流出生物反應器罐，進入專門的“收獲”回流液容器中，而生物反應器內的培養(yǎng)基置換為新鮮的培養(yǎng)基。結果是可從生物反應器獲得濃縮的小體積收獲原液，從而簡化下游操作，并降低其尺寸。在本研究中，我們在收獲瓶前增加了在線澄清過濾器，以降低對中空纖維過濾器的污染。該系統(tǒng)可在單個標準尺寸的生物安全柜內進行所有上游工藝和初步的下游工藝。

由于scale-X carbo生物反應器舒適的人體工程學設計，我們選擇該系統(tǒng)用于開發(fā)可放大的工藝，以生產基于重組水泡口炎病毒（rVSV）的拉沙病毒（LASV）疫苗。VSV是一種反義單鏈RNA病毒，可導致多種家畜的自限性疾病，且可感染人類，形成輕微的流感樣綜合征或保持無癥狀。VSV是一種有囊膜的子彈裝病毒，粒徑約70nm-200nm。較大的外源基因可包裝進VSV并表達，使這種病毒成為理想的活病毒疫苗候選。此前，已經有報導構建了多種表達埃博拉病毒（EBOV）、馬爾堡病毒（MARV）和LASV糖蛋白的載體。但是，用于生產物料所需的規(guī)�？赡軙�是一個限制，特別是當使用貼壁細胞作為生產細胞時。在本報告中，我們證實了使用Univercells的scale-X生物反應器生產rVSV-LASV（VSVΔG/LASVGP）的工藝。與傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶生產工藝相比，使用scale-X carbo生物反應器生產獲得的病毒產量可增加4-log。此外，實驗檢測了代謝物數據；谷氨酰胺、氨、葡萄糖和乳酸趨勢均與病毒感染前生物反應器中的正常細胞生長一致。數據證實，相比傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶生產，scale-X carbo生物反應器可獲得更高的單位面積病毒產量，這將顯著提升單次運行可生產的劑量數�？偨Y來說，我們介紹了一種有能力在低環(huán)境足跡條件下，進行高產量病毒疫苗生產的新型可放大固定床生物反應器系統(tǒng)。

2. 材料和方法

2.1. 固定床生物反應器培養(yǎng)系統(tǒng)

所有實驗使用10m² scale-X Carbo生物反應器（Univercells，Brussels，Belgium）和在線切向流過濾（TFF）組件（圖1）。生物反應器以1.0-2.0x10⁴ cells/cm²的目標接種密度接種（按生廠商說明），細胞擴增階段的工藝參數按生產商程序設置。培養(yǎng)參數確定為：溫度35至37℃，pH 7.0至7.6，攪拌設置為250RPM，工作體積1.6L。外置的加熱培養(yǎng)基循環(huán)回路連接至生物反應器，以支持高細胞密度�；芈穬鹊呐囵B(yǎng)基體積足夠大，以支持0.2-0.4mL/cm²的培養(yǎng)基與表面積比例。循環(huán)速度支持每天20-30個生物反應器體積。除基礎補液管路為1/8”內徑外，反應器上的管路尺寸大于1/4”內徑。

2.2. 細胞擴增

Vero細胞系（Ology Bioservices Inc.）在專用無血清培養(yǎng)基（Ology Bioservices Inc.）中培養(yǎng)。細胞使用培養(yǎng)瓶和細胞工廠擴增，接種密度為1.0-1.5x10⁴cells/mL。罐置于37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)。細胞傳代，直到達到約1.0-2.0x10⁹總活細胞量。收獲時，細胞單層用1X DPBS緩沖液（Gibco，Waltham，MA）漂洗，以去除過量的耗竭培養(yǎng)基，之后使用TrypLECTS Select（Gibco，Waltham，MA）解離。離心去除TrypLE，細胞重懸于新鮮培養(yǎng)基。在Vi-CELL XR 細胞活性分析器（Beckman Coulter，Brea，California）上進行細胞計數。

2.3. 細胞密度和代謝物分析監(jiān)測

插在固定床內的一次性使用采樣條每日取出，使用裂解緩沖液和細胞核計數，確定細胞密度。采樣條裂解5min，然后渦旋1min。細胞核用結晶紫染色，以觀察完整的細胞核。通過從無菌采樣端口提取培養(yǎng)基樣品，使用BioProfile®FLEX2（Nova Biomedical，Waltham，MA）每日檢測代謝物濃度。當離線檢測偏離在線探針讀數>±0.05pH單位時，執(zhí)行pH偏移。

2.4. 感染過程

含有拉沙病毒（LASV）Josiah糖蛋白的重組水泡口炎病毒（rVSV）（去除糖蛋白G）（VSVΔG/LASVGP）由NIAID根據材料轉移協議（LAB-18-P_LV-22僅用于體外使用，且僅用于培訓和研究目的）慷慨提供。滴度為4.9x10⁸ pfu/mL的VSVΔG/LASVGP原液用于所有生物反應器感染研究。接種后5天或達到峰細胞密度（以谷氨酰胺檢測的氮源剝奪為準）后，使用病毒接種液進行生物反應器感染。簡單來說，生物反應器排干耗竭的培養(yǎng)基，然后灌滿含有病毒接種液的新鮮培養(yǎng)基。循環(huán)回路在感染時斷開，以進行批量模式感染。每個運行以MOI 0.05的感染復數感染，感染過程進行48至72h。一旦采樣條上的細胞計數耗盡，開始收獲。培養(yǎng)瓶容器在與生物反應器相同的時間，使用相同的病毒感染接種液，進行感染。

圖1. scale-X carbo生物反應器。scale-X carbo系統(tǒng)示意圖，30m²生物反應器（紅色）位于生物反應器控制臺中央。5L收獲瓶位于控制臺右手側，在線TFF組件位于收獲瓶后方。位于控制臺左手側的是控制面板，允許用戶啟動或暫停生物反應器泵。此外，接種液和基礎培養(yǎng)基瓶位于生物反應器左側。在描述的實驗中，使用10m²，即為30m²生物反應器的1/3。外置循環(huán)回路未顯示。
 

2.5. 病毒收獲

收獲原液通過由Sartopure PP38μm過濾器和Sartopore 2 0.8/0.45μm過濾器組成的兩步深層過濾器鏈，收集進入二級容器。在運行4中，罐初步清空后，生物反應器用額外的1L新鮮培養(yǎng)基潤洗，以沖洗掉固定床中所有殘料的病毒顆粒。該沖洗液通過深層過濾器，以TFF步驟，進行病毒濃縮。收獲原液使用100kD中空纖維TFF組件濃縮2倍。培養(yǎng)瓶容器在與生物反應器相同的時間內進行收獲，收獲原液以1000g離心10min澄清。

圖2. Carbo生物反應器示意圖。突出顯示了以編織篩網基質圍繞的雙層非編織篩網（藍色）。此外，顯示液流方向，以指示培養(yǎng)基在整個生物反應器內的流動。用于在線pH和DO監(jiān)測的探針位于生物反應器中央。

2.6. 噬斑分析

收獲原液取樣，以Ology Bioservices,INC.優(yōu)化的方法，通過噬斑分析定量，檢測病毒滴度。簡單來說，先生成10倍連續(xù)稀釋液，用結晶紫染色15min，漂洗，噬斑計數。

3. 結果

3.1. Scale-X carbo系統(tǒng)中的Vero細胞生長

Scale-X carbo系統(tǒng)的獨特設計可允許液體在固定床內流動，并通過內部集中通道回流到葉輪，形成連續(xù)的降膜機制（圖2）。降膜機制可在生物反應器的覆蓋層內實現氣體交換。使用生產商提供的指南和工藝參數，進行了工藝建立運行（運行1）。該運行確定Vero細胞系可在10m²固定床生物反應器內生長至一致的細胞密度（表1）。隨后的運行設計用于建立不同的操作條件，以達到最佳細胞密度（圖3）。如圖4所示，在所有的運行中，從細胞接種（第0天）后的第1到5天，可觀察到均勻的細胞生長。在運行3中，允許細胞多生長1天，以確定多出的1天是否可導致細胞顯著的生長。結論是，等到第6天感染不會形成更高的細胞密度而獲得最大化的病毒生產。所以，推斷最佳細胞生長發(fā)生在接種后第5天，即第5天可進行Vero細胞病毒感染，以觸發(fā)進一步的病毒生產。
 

3.2. 代謝物趨勢

在細胞生長階段，檢測了主要代謝物的活性，包括谷氨酰胺和葡萄糖的消耗以及隨后的氨和乳酸的生產（圖4）。細胞接種時的谷氨酰胺濃度為2.4±0.2 mmol/L，并被消耗至低于分析的線性范圍。同樣的，接種時的葡萄糖濃度為17.57±1.27 mmol/L，并被消耗至低于分析的線性范圍。最高乳酸生產值為16.71mmol/L，最高氨離子濃度為2.77 mmol/L。

3.3. VSVΔG/LASVGP的生產

在第一個病毒生產運行中（運行1），接種后第5天，以MOI 0.05感染復數感染VSVΔG/LASVGP。感染后，可在生物反應器內的上清液中觀察到顯著的細胞碎片，感染后第2天，開始病毒收獲。生物反應器排液，以收獲含有病毒的上清液，進行培養(yǎng)基潤洗步驟，以從滯留體積中沖洗出所有殘留的病毒。VSVΔG/LASVGP收獲完成后，使用標準噬斑分析檢測病毒滴度。滴度計算為4.25x10¹² pfu/mL，對應的總滴度為單次運行6.80x10¹⁵pfu，標準化滴度為6.80x10¹⁰pfu/cm²（表2）。

圖3. 各個生物反應器運行的細胞生長趨勢。所示細胞計數至生物反應器感染時間點。不同的運行標注如下：運行1（▲）、運行2（t）、運行3（t）以及運行4（l）。

圖4. 各個運行中，10L carbo生物反應器內Vero細胞生長的代謝物濃度趨勢。分析感染前，與細胞生長相關的代謝物，谷氨酰胺（A）、氨（B）、葡萄糖（C）以及乳酸（D）。不同的運行標注如下：運行1（▲）、運行2（t）、運行3（t）以及運行4（l）。

運行2和3的部分病毒生產參數與運行1不同。首先，病毒收獲在感染后第3天開始，其次，收獲原液通過2-步深層過濾鏈過濾，以去除過量的細胞碎片，然后收集到回流罐中。深層過濾器收獲后，有極少量的病毒被截留（數據未顯示），2個運行的總體病毒產量與運行1接近。運行2和3原液中的平均病毒滴度分別為5.03x10^、¹² pfu/mL和2.90x10¹² pfu/mL，對應的膜表面積標準化收獲滴度為7.55x10¹⁰ pfu/cm²和4.35x10¹⁰ pfu/cm²。兩個運行以及前三個運行之間，計算滴度無統(tǒng)計學差異。

圖5. 在線純化策略示意圖。Scale-X carbo生物反應器連接至在線TFF組件和收獲容器。某些情況中，在收獲瓶前的生物反應器流出管路上增加深層過濾器（未顯示），作為下游工藝部件。

最后一個運行（運行#4）使用在線切向流過濾（TFF）步驟，以在原液收獲并以深層過濾器澄清后，進行病毒濃縮。在線TFF、生物反應器以及回流容器的示意圖如圖5所示。所有細胞接種和感染參數按運行2和3中執(zhí)行的程序進行。但是，病毒原液收集后，上清液物料使用TFF進行濃縮。TFF工藝在之前的運行中沒有進行。TFF步驟的加入可實現對生物反應器進行額外的漂洗，以收集可能位于生物反應器固定床中的所有殘留病毒。病毒收獲液從1.6L濃縮至750mL，收獲原液的滴度計算為1.03x10¹²pfu/mL（表2）。TFF濃縮步驟完成后，回流液的滴度檢測為2.47x10¹²pfu/mL（表2）。該滴度對應為濃縮2X，多出的病毒可能是漂洗后從固定床回收的病毒，也可能與噬斑分析本身的差異性有關。

最后，當與使用T-225培養(yǎng)瓶或CELLSTACK-10進行的生產進行比較時，可發(fā)現使用scale-X生物反應器可顯著提高病毒生產的量。每mL可增加超4 log對數的病毒，且與每個獨立生物反應器運行相關的參數無關，對比CELLSTACK-10和T-255生產，這相當于單個生物反應器可增加4-7 log對數的病毒。總體來看，scale-X carbo運行的結果證實了使用這種生物反應器是進行活病毒生產、澄清和濃縮的有效方法。

4. 討論

一次性使用技術仍是生物制品生產的金標準，而其可放大性限制了貼壁細胞固定床生物反應器系統(tǒng)的使用。scale-X生物反應器產品線可從2.4m²臺式系統(tǒng)放大至600m²商品化規(guī)模系統(tǒng)。scale-X carbo生物反應器已被證實是可克服其它固定床生物反應器系統(tǒng)可放大性局限的有用工具。類似的系統(tǒng)沒有中間性表面積規(guī)模選擇，如10m2或30m²。而該規(guī)�？蔀槎喾N應用提供所需物料，如臨床前毒理學研究批次、下游方法和分析方法的開發(fā)、生產對照物料以及臨床I期研究。其它固定床生物反應器系統(tǒng)的一個限制是，當放大到更大規(guī)模的固定床直徑時，產率會降低。scale-X carbo系列規(guī)模放大時增加固定床高度，而保持直徑恒定，從而降低了規(guī)模放大過程的影響。此外，此類生物反應器的另一個與其它固定床生物反應器相區(qū)別的獨特之處是固定床的基質。固定床由5 cm²寬的非編織PET織物和聚丙烯篩網交替螺旋纏繞管式組成。PET織物提供用于細胞貼附和生長的三維微環(huán)境；聚丙烯篩網提供結構和液流通道。固定床的螺旋設計結合生物反應器高度的增加可實現生物反應器內均勻的徑向和垂直細胞分布，這可通過插入到固定床內的PET織物采樣條進行監(jiān)測，采樣條可通過生物反應器系統(tǒng)頂蓋內的取樣端口進行采集PET樣條。八個取樣端口圍繞頂蓋均勻分布，其特征是具有一個鎖定端口系統(tǒng)，系統(tǒng)包括一個磁性連接至塑料桿的螺帽，而塑料桿連接至PET條。螺帽和塑料桿系統(tǒng)可從生物反應器簡單地取出，桿和帽的磁性可方便地將桿從帽上取下，并更換螺帽后放回端口，而維持無菌操作。然后可從桿上取下采樣條，PET條裂解細胞并細胞核計數后，用于確定單位面積的細胞數。取樣端口的位置和PET條在整個固定床內的分布可用于確定細胞密度和分布。

此外，PET-聚丙烯篩網螺旋技術由于通過螺旋固定床聚丙烯篩網的培養(yǎng)基液流模式，可實現均勻的營養(yǎng)物供應（圖2）。培養(yǎng)基循環(huán)流速設置可達到每天約25個培養(yǎng)基體積置換。置換用于提供新鮮的營養(yǎng)物質，并在毒性代謝物積聚前將其去除，結果表明，在生物反應器內的細胞擴增階段，可獲得一致的細胞生長。如果細胞的代謝要求需要增加循環(huán)，可進行更高的置換。

最后，該生物反應器包括一個在線TFF中空纖維系統(tǒng)，可通過連續(xù)且無菌的方式，進行病毒產物的純化和濃縮。為了緩和收獲過程中，生物反應器液流中細胞碎片導致的中空纖維系統(tǒng)污染，可在流出生物反應器的管路系統(tǒng)上焊接深層過濾器鏈，進行澄清。這可在在線純化過程中，實現額外的澄清步驟，并捕獲細胞碎片。當在生物反應器內增殖可裂解細胞的病毒并通過在線TFF系統(tǒng)純化病毒產物時，這是必不可少的。

本次研究的目的，首先是確定Vero細胞系在結合至生物反應器PET織物床后是否可增殖，其次是比較在生物反應器與傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶中進行的病毒疫苗首選物生產的結果。當將細胞計數按相等表面積進行標準化處理后，生物反應器內的細胞密度高于T-225培養(yǎng)瓶或CellSTACK-10容器內觀察到的最高細胞密度。這意味著，僅從更高的單位面積細胞數量，即可推測其可獲得更高的病毒產量，這還沒有考慮可能獲得更高病毒生產的細胞整體適應性因素。此外，在生物反應器內生長的細胞代謝物趨勢在4個運行中保持一致，這表明了整體的細胞適應性。對于病毒生產，由于使用的體積不一樣，很難根據容器和生物反應器的體積來比較滴度。例如，T-225培養(yǎng)瓶的收獲體積約為60-65mL，CellSTACK-10和scale-X的收獲體積分別約為1.5L和1.8L。如表2所示，除了總收獲量外，滴度按單位體積報告。但是，為對生產進行標準化比較，滴度按單位面積報告。這可對不同容器和生物反應器內的病毒生產進行更加全面的比較。平均來說，T-225產量為2.67x10⁶pfu/cm²，而CellSTACK-10產量約為5.77x10⁸ pfu/cm²。4個獨立scale-Xcarbo運行的平均滴度約為5.09x10¹⁰ pfu/cm²。按表面積進行標準化處理后，相比CellSTACK-10，scale-X carbo生物反應器病毒產量約增加了2 log，而相比T-225，增加了4 log病毒。此外，scale-X carbo生產獲得的高滴度是使用約1.6L的小體積培養(yǎng)基獲得的。更小的體積可降低下游工藝中與澄清、純化和濃縮相關的復雜性。增加用于澄清的深層過濾器以及用于純化和濃縮的在線TFF，可實現連續(xù)的無菌下游工藝，并將病毒產物收集在回流容器中。下游純化工藝通常會導致一定程度的病毒產物損失，但是，使用在線TFF中空纖維濃縮系統(tǒng)沒有導致病毒產物的損失。這可能是由于收獲過程中對生物反應器進行了沖洗，從而回收了可能截留在固定床基質中的殘留病毒，也可能是因為增加了用于細胞碎片澄清的深層過濾器以及過濾器孔徑的正確選擇。在線TFF可在病毒收獲后進行漂洗步驟，以收集殘留的病毒，且由于TFF可實現2-3X的濃縮，所以抵消了漂洗增加的體積。最后，由于不同病毒的粒徑不同，所以需要根據粒徑來選擇正確的過濾器，以避免純化過程中，由于過濾器而導致的病毒損失。

綜上所述，病毒疫苗生產的增加可能源于多方面的因素，但主要是單位面積細胞數的增加以及細胞的整體適應性，這可能是由于PET纖維床的幾何結構實現了細胞密度均一性、捕獲以及貼附性。最終，這些因素實現了在培養(yǎng)基流動通過固定床聚丙烯篩網層時均勻的營養(yǎng)物供應。該系統(tǒng)解決了疫苗低成本、高產量生產的關鍵需求，標志著向活病毒疫苗的大規(guī)模生產又邁進了一步。最后，單位面積滴度的增加可提高單次運行可生產的劑量數。

原文翻譯：D.M.Berrie, R.C.Waters, C.Montoya, et al., Development of a high-yield live-virus vaccine production platform using a novel fixed-bed bioreactor. Vaccine, 2020, 38:3639-3654.

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