scale-X™ 生物反應器在病毒載體生產(chǎn)中的應用
Vero 細胞均勻生長的應用筆記
摘要
scale-X 生物反應器是一種新型固定床系統(tǒng)，可用于貼壁和懸浮細胞系的培養(yǎng)。設備單元占地小，而具有相當大的表面積，從而可獲得極高細胞密度。本研究比較了在scale-X hydro生物反應器和標準微載體培養(yǎng)體系中進行的貼壁Vero細胞培養(yǎng)。兩種系統(tǒng)可獲得相似的單位面積細胞濃度。隨后，展開螺旋卷式固定床顯示，細胞在軸向和徑向上具有均勻的分布。這表明在生物反應器內(nèi)部具有均勻的液體流動和細胞附著。觀察到的均質(zhì)的細胞生長是一個重要的規(guī)模放大因素，以按可重復的方式，實現(xiàn)可用表面積最大限度的利用。
scale-X生物反應器簡介
大多數(shù)病毒疫苗的生產(chǎn)工藝基于貼壁細胞平臺。典型的培養(yǎng)系統(tǒng)，如滾瓶、多層細胞培養(yǎng)皿和微載體生物反應器，在規(guī)模放大時，都有一定的限制。為了克服潛在的規(guī)模放大限制，簡化生產(chǎn)，固定床生物反應器是一個極具價值的替代選擇。創(chuàng)新的scale-X生物反應器是一種可規(guī)模放大的固定床系統(tǒng)，可從研發(fā)（2.4 m2生長表面積）放大到中試（10和30m2生長表面積）和生產(chǎn)規(guī)模（200和600m2生長表面積；圖1）。scale-X專利技術使用了一種結(jié)構化的螺旋卷式非編織聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）固定床，以減少局部過度壓實和死區(qū)，同時實現(xiàn)可用內(nèi)表面積及質(zhì)量的最佳利用，獲得批次間的高可重復性（圖2）。
材料、方法 & 設備
固定床工藝：scale-X hydro生物反應器
細胞系和工藝條件
用于細胞密度和分布評估的方法
» 可從固定床提取12根整合的取樣條（每根1面積2.15 cm2）在1 mL細胞裂解緩沖液中充分混合3 min。消化的細胞核用結(jié)晶紫染色并進行計算。
» 當達到目標細胞密度后，取出固定床，小心地鋪開，剪下確定的1 cm2面積（圖3）。條帶上的細胞用試劑A100（ChemoMetec）裂解，并使用血細胞計數(shù)器對細胞核進行計數(shù)。
對照工藝：在攪拌罐生物反應器（STR）中進行Cytodex® 1微載體培養(yǎng)
細胞系和工藝條件
用于細胞密度和分布評估的方法
» 從生物反應器取5 mL樣品體積。進行三次的洗脫后，用0.1 M檸檬酸、0.1%結(jié)晶紫和0.1% Triton X-100溶液裂解細胞。
» 37℃孵育1小時后，用血細胞計數(shù)器對染色的細胞核進行計數(shù)。該方法詳細描述，參見Trabelsi et al.文章（Khaled Trabelsi, 2004）。
工藝參數(shù)（用于兩種培養(yǎng)）
» 添加4 mM谷氨酰胺的無血清培養(yǎng)基（VP-SFM， Gibco™）
» 補加葡萄糖和谷氨酰胺原液，以分別防止兩種底物低于8 mM和2 mM
» 使用CO2和 0.5 NaHCO3（微載體）或0.5 NaOH（scale-X）將pH值控制為7.2
» 溫度設定點為37℃
» 溶氧設定點為50%（頂部空間通氣）
VERO細胞生長
比較不同生物反應器系統(tǒng)內(nèi)的最大Vero細胞密度（Kiesslich，2020）（圖4）：
scale-X hydro 生物反應器（2.4 m2）:2.7 x 105 cells/cm2
STR Cytodex® 1（0.75 m2）：2.4 x 105 cells/cm2
不同的細胞接種密度導致了不同但相當?shù)纳L曲線圖。scale-X生物反應器中的單位面積細胞密度（2.7x 105 cells/m2）略高于微載體培養(yǎng)（2.4 x 105 cells/m2）。兩種系統(tǒng)的培養(yǎng)基使用量接近，為2.1 - 2.2 ×109 cells/L培養(yǎng)基。當考慮兩個系統(tǒng)在同等產(chǎn)量下的反應器體積時，固定床生物反應器的設備占地顯著降低（降低5倍）。
圖4. 相比標準微載體培養(yǎng)，scale-X hydro生物反應器中的Vero細胞生長，由Kiesslich et al.（2020）提供。
Univercells進行了延長的Vero細胞生長研究（圖5）。在scale-X hydro生物反應器中進行了多次實驗（n=26），獲得了可重復的細胞密度，平均為2.5×105 cells/cm2。規(guī)模放大至更大的scale-X carbo生物反應器（10m2和30m2），可獲得相似的單位面積細胞密度。
圖5. Vero 細胞曲線圖：試驗以Vero 細胞生長在不同scale-x 規(guī)格體積（內(nèi)部數(shù)據(jù)）
在結(jié)構化、螺旋卷式固定床中的Vero細胞分布
在培養(yǎng)的不同階段（2.7×105 cells/cm2和5.3×105 cells/cm2時，圖6），對Vero細胞分布進行了研究。為此，從展開的固定床中提取了9個樣本，并測定細胞密度。
在scale-X hydro生物反應器中，Vero細胞在固定床中軸向和徑向均勻分布。研究進行了進一步的計算機流體動力學研究，結(jié)果顯示，在結(jié)構化固定床中沒有死區(qū)和非均勻性（數(shù)據(jù)未顯示）。均勻的細胞生長使可用表面積得到充分利用。
圖6. scale-X生物反應器的結(jié)構化固定床中的Vero細胞生長分布。
細胞沿徑向（從中心半徑）和軸向（固定床高度）均勻分布。（a.）由Kiesslich et al.（2020）友情提供，（b.）在Univercells實驗室進行。
總結(jié)
在這兩種工藝中，貼壁Vero細胞達到了相同的密度。當轉(zhuǎn)移到更大的固定床scale-X生物反應器時，達到了類似的細胞生長趨勢和最高單位面積細胞密度。最后，對Vero細胞生長分布的研究顯示，固定床內(nèi)有均勻的細胞貼壁和生長。與微載體工藝相比，固定床的緊湊設計使設備占地面積降低5倍。
總體而言，結(jié)果表明，結(jié)構化的scale-X固定床生物反應器系統(tǒng)是傳統(tǒng)“規(guī)模擴展”技術的合適替代方案，后者如多層培養(yǎng)皿和滾甁，也包括具有一定技術挑戰(zhàn)性的培養(yǎng)系統(tǒng)，如微載體工藝。
目前的scale- X生物反應器可以轉(zhuǎn)化至生產(chǎn)規(guī)模（600 m2），并整合到連續(xù)的NevoLine™生產(chǎn)平臺中。NevoLine系統(tǒng)將強化的上游工藝與連續(xù)的下游工藝相結(jié)合，以降低資本投入和運營成本，實現(xiàn)低成本、大規(guī)模的生產(chǎn)能力。
參考文獻
Khaled Trabelsi, S. R. (2004). Comparison ofvarious culture modes for the production of rabies virus by Vero cells grown onmicrocarriers in a 2-l bioreactor. Enzyme and Microbial Technology.
Kiesslich, S.V.-C.-F. (2020). Serum-free production of rVSV-ZEBOV in Vero cells:Microcarrier bioreactor versus scale-X™ hydro fixed-bed. Journal of Biotechnology.
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