特殊加工工藝血清的種類與使用注意事項

正因為血清來源于動物，含有細(xì)胞培養(yǎng)中所需的各種營養(yǎng)（血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機(jī)物等），所以奠定了血清是細(xì)胞培養(yǎng)實驗中最普遍試劑的基礎(chǔ)。血清通常用作細(xì)胞生長的添加物，擁有多種功能和用途，如：富含大分子蛋白，低分子量的營養(yǎng)素，作為氨基酸、碳水化合物、維生素的額外來源；提高介質(zhì)的緩沖能力；可結(jié)合或中和有毒成分；減少細(xì)胞氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡；提供促進(jìn)生長的因子，有助細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境。

成分	濃度	成分	濃度
蛋白和多肽	-	磷脂	0.7-3.0 mg/ml
白蛋白	20-50 mg/ml	丙酮酸	2-10 ug/ml
胎球蛋白	10-20 mg/ml	碳水化合物	-
纖連蛋白	1-10 ug/ml	葡萄糖	0.6-1.2 mg/ml
球蛋白	1-15 mg/ml	乳酸	0.5-2.0 mg/ml
α-抗胰蛋白酶	0.5-2.5 mg/ml	多胺	-
轉(zhuǎn)鐵蛋白	2-4 mg/ml	丁二胺,亞精胺	0.1-1.0 uM
生長因子	-	尿素	170-300 ug/ml
EGF, PDGF, IGF-I, IL-1	1-100 ng/ml	無機(jī)物	-
氨基酸	0.01-1.0 uM	鈣，氯化物，鉀，磷	-
脂質(zhì)	-	激素	-
膽固醇	10 uM	胰島素	1-100 ng/ml
脂肪酸	0.1-1.0 uM	皮質(zhì)醇	10-200 nM
亞油酸	0.01-0.1 uM	維生素	10 ng-10 ug/ml

在之前的文章中，我們介紹過血清通過牛齡進(jìn)行分類，可大致分為：胎牛血清（Foetal Bovine Serum，簡稱FBS）、國產(chǎn)胎牛血清（并無明確定義，但通常用此命名）、新生牛血清（Newborn Calf Serum，簡稱NBCS，或稱小牛血清）、成年牛血清（Adult Bovine Serum，簡稱ABS）。點(diǎn)擊文字即可查看文章。

不同牛齡血清所含的促細(xì)胞生長因子、促貼附因子、激素及其他活性物質(zhì)等組分與比例不同。

▽ 比較

但這幾種血清也不一定可以滿足所有實驗要求，那么就出現(xiàn)了一些根據(jù)實驗要求進(jìn)行了特殊加工的胎牛血清。今天我們就來聊一聊這些特殊胎牛血清的用途~

透析胎牛血清

常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)需要添加血清來維持細(xì)胞的增殖能力，盡管血清可以滿足一般細(xì)胞培養(yǎng)需求，但在進(jìn)行營養(yǎng)成分優(yōu)化和標(biāo)記特定成分進(jìn)行研究的實驗中，仍需要去除某些特定的成分，常用的去除方法有透析。透析是將血清循環(huán)通過中空纖維，并在血清中補(bǔ)充生理鹽水以維持滲透壓，移除分子量小于10,000Da的小分子，如氨基酸、葡萄糖、鹽離子和未結(jié)合的蛋白等。
因此透析胎牛血清主要用于關(guān)注小分子濃度的特殊研究，包括：研究蛋白質(zhì)組學(xué)，同位素標(biāo)記、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和報告基因分析、報告基因細(xì)胞系的篩選等。

 

細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)（簡稱SILAC）

這是一項以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，全稱為Stable isotope labeling with amino acids in cell culture （SILAC）。它將¹³C或¹⁵N標(biāo)記的氨基酸摻入到培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，來標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)，一般培養(yǎng)5-6代，細(xì)胞中的蛋白質(zhì)將都被同位素標(biāo)記。然后質(zhì)譜分析，即可比較經(jīng)過不同處理的細(xì)胞，其內(nèi)部蛋白質(zhì)豐度的變化。它還可用于正常細(xì)胞與病理狀態(tài)細(xì)胞二者的比較。為避免胎牛血清中天然氨基酸的干擾，這時就需要用到透析胎牛血清，以保證摻入細(xì)胞蛋白中的氨基酸均為標(biāo)記氨基酸（常采用賴氨酸或精氨酸）。

工程細(xì)胞株的篩選

以常見的工程細(xì)胞株CHO-DFGRˉ為例，該細(xì)胞自身缺乏二氫葉酸還原酶（DHFR），必須在添加了次黃嘌呤、胸腺嘧啶和甘氨酸的培養(yǎng)液中才能得以存活。如將含有目的基因與DHFR基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，則可以得到在不含上述添加劑的培養(yǎng)基上也能生長的細(xì)胞克隆。通過甲氨蝶呤（MTX）進(jìn)一步篩選，可進(jìn)一步得到能表達(dá)大量目的蛋白的細(xì)胞克隆。這時的胎牛血清由于不含有次黃嘌呤和胸腺嘧啶等，也常作為選擇培養(yǎng)基的一部分，參與陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的篩選。

研究某些因子如核苷酸或微量元素如硒、鋅對某種類型細(xì)胞增殖、分化的影響。這時也需要用透析胎牛血清，以避免培養(yǎng)體系中天然存在的這些物質(zhì)的干擾。
（來源網(wǎng)絡(luò)）

碳吸附胎牛血清

在進(jìn)行營養(yǎng)成分優(yōu)化和標(biāo)記特定成分進(jìn)行研究的實驗中，需要去除某些特定的背景成分，常用的去除方法有碳吸附，使用活性碳和右旋糖苷去除血清中的激素。

活性炭能夠結(jié)合脂溶性分子，通過碳吸附可降低血清中許多激素及生長因子的濃度，如雌二醇、皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、孕酮、B類維生素、睪酮及T3、T4、前列腺素等。該血清適用于上述一些分子可能干擾實驗結(jié)果的實驗中，對于那些需要這些分子的細(xì)胞培養(yǎng)，也可能降低細(xì)胞生長性能。

碳吸附胎牛血清用于體外培養(yǎng)，去除背景值以驗證激素的作用效果，研究包括醇類受體連接，細(xì)胞受體類固醇調(diào)節(jié)，各種組織激素分泌和甲狀腺激素功能。

適用于：培養(yǎng)干細(xì)胞、原代細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、人類癌細(xì)胞、人類骨髓細(xì)胞、白血病細(xì)胞、人類胚肺成纖維細(xì)胞、人類腦神經(jīng)細(xì)胞和瘤細(xì)胞等細(xì)胞。

去外泌體胎牛血清

外泌體由分泌性細(xì)胞分泌，存在于所有的生物體液中，包括血液、尿液、唾液、乳汁和腦脊液中。它們隨后被其他細(xì)胞吸收并發(fā)揮生物活性。

△外泌體

胎牛血清中含有大量的外泌體，但在外泌體研究中，如果仍然使用胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞，并通過收集上清液來提取外泌體進(jìn)行實驗，那么胎牛血清中本身的牛源外泌體將會對實驗分析造成極大的干擾。去外泌體血清是將由無菌采集的健康胎牛血清經(jīng)過過濾，去除≥99%的胎牛血清內(nèi)源外泌體，還可使細(xì)胞在培養(yǎng)時與未處理的胎牛血清具有相同的增殖速率和形態(tài)。

因此，去外泌體血清主要用于細(xì)胞體外的增殖培養(yǎng)，收獲目標(biāo)細(xì)胞的外泌體。

四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)胎牛血清

普通胎牛血清中一般會含有四環(huán)素（Tet），當(dāng)使用非常敏感的Tet-誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)時，研究人員往往會遇到非預(yù)期的基因表達(dá)的問題，為了確保精確地基因表達(dá)，建議使用四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)胎牛血清，應(yīng)用于使用敏感四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)(Tet-on, Tet-off)，以及其它對四環(huán)素敏感的實驗中。

低IgG胎牛血清

IgG是胎牛血清中發(fā)現(xiàn)的最常見的抗體，低IgG血清主要通過A-Sepharose處理，使血清能夠保留原有的生物活性，同時降低血清的IgG含量，低于5μg/ml。低IgG胎牛血清適用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。
因此，低IgG胎牛血清有利于單克隆抗體的純化，用于研究抗體和病毒反應(yīng)、細(xì)胞表面抗原表位。

去脂胎牛血清

去脂胎牛血清通過固體基質(zhì)脫脂作用去除內(nèi)源性脂類、甘油三酯和膽固醇，含量僅為標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的1/3。

去脂胎牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)中用量較多，其含有豐富的細(xì)胞生長必須的營養(yǎng)成分，常用于動物細(xì)胞的體外培養(yǎng)，具有極為重要的功能。

• 1. 提供對維持細(xì)胞指數(shù)生長的激素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物以及主要的低分子營養(yǎng)物

• 2. 提供結(jié)合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)變它們所結(jié)合的物質(zhì)活力。

• 3. 有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱源質(zhì)結(jié)合，起到解毒作用。

• 4. 是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基上所需因子來源。

• 5. 起酸堿緩沖液作用。

• 6. 提供蛋白酶抑制劑，使在細(xì)胞傳代時剩余胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受傷害。

去脂胎牛血清可用于蛋白激酶CK2-α’與腺樣囊性癌肺轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究：

• 1. 蛋白激酶是酶類這個家族中最龐大的一員，被用來完成蛋白磷酸化作用的催化，這是控制細(xì)胞生命活動中最通常的機(jī)制。其中最具有效性的蛋白激酶之一可能就是CK2。蛋白激酶CK2（protein kinase CK2, PKCK2），過去曾經(jīng)被稱為酪蛋白激酶-2或Ⅱ（cascin kinase2 or Ⅱ）。它是由兩個催化亞基（aa’）和兩個調(diào)節(jié)亞基（ββ）構(gòu)成的不均一四聚體。

• 2. 蛋白激酶CK2是由兩個分別為42—44KDa和38KDa的aa’ββ型異四聚體結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定,在體外只有在變性的條件下才能被解離。除了細(xì)胞基質(zhì),一些病毒蛋白也被CK2所磷酸化。蛋白激酶CK2在轉(zhuǎn)錄、信號、增殖，并且在導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的各細(xì)胞步驟中發(fā)揮作用。

熱滅活系列血清

加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。啟動的補(bǔ)體系統(tǒng)參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，啟動淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化。在免疫學(xué)研究中，培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。
實驗顯示，熱滅活血清對大多數(shù)的細(xì)胞而言是非必需的，對于非必須的細(xì)胞來說血清滅活對于細(xì)胞生長只有微小甚至無任何作用，還可能造成生長速率降低，沉淀物還會顯著增多，不利于細(xì)胞觀察。因此，若非必須，不需要對血清進(jìn)行滅活處理。
如若需要使用熱滅活血清，可通過提高血清溫度到56℃，并且保持該溫度30分鐘完成。建議加放空白對照（同體積水）使用溫度計測溫，以測得溫度為56℃時為計時起始點(diǎn)，加熱中可不時輕度旋轉(zhuǎn)混勻血清。

 

☆ 血清的使用方法

血清從冰凍區(qū)中取出后（切勿直接將血清從-20℃置入37℃解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀），放置于2℃～8℃中使之融化，解凍過程中間歇地輕輕搖晃均勻，待全部溶解后再分裝或直接使用。完全融解的血清從4℃拿出，按要求比例（5%-20%）加基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置成完全培養(yǎng)基，建議使用不完時，置于4℃冰箱存放并于1-2周內(nèi)用完。

 

☆ 使用血清時的注意事項

血清沉淀的物質(zhì)主要有：纖維蛋白（絮狀沉淀），脂蛋白，冷凝集素，玻連蛋白，胎球蛋白，磷酸鈣（顯微鏡下小黑點(diǎn)沉淀），膽固醇等。

哪些原因容易導(dǎo)致血清沉淀：

1. 溫度改變太大，血清由-20℃直接放入37℃解凍，因溫度改變劇烈容易導(dǎo)致沉淀。

2. 血清在室溫或4℃冰箱放置時間太久，血清中的不穩(wěn)定成分會被破壞，影響細(xì)胞生長效果；導(dǎo)致血清品質(zhì)變差，也會產(chǎn)生沉淀。

3. 血清分裝凍存時，注意在不產(chǎn)生氣泡的情況下?lián)u晃均勻，避免因血清成分濃度改變產(chǎn)生沉淀。

4. 血清滅活后容易產(chǎn)生沉淀，如需使用滅活血清，請按56℃，30分鐘，輕微搖晃原則操作，滅活溫度過高、時間過長、搖晃不均都容易產(chǎn)生沉淀。

如有血清沉淀，分裝后進(jìn)行離心處理，建議400g離心5分鐘，取上清使用。

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