免疫治療熱門靶點(diǎn)CTLA-4的研究概括與應(yīng)用背景

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CTLA-4（細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4；也稱為CD152）是免疫球蛋白家族的成員，在小鼠體內(nèi)是由Ctla-4基因編碼，在人體內(nèi)是由CTLA4基因編碼的一種跨膜蛋白，主要表達(dá)在活化T細(xì)胞表面，特別的是，它在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）中組成型表達(dá)。

CTLA-4與上周我們提到的CD28具有高度同源性，而且它們有著相同的配體CD80（也稱為B7-1）和CD86（也稱為B7-2），但是它們的功能截然相反。CD28屬于共刺激性（co-stimulatory）免疫檢查點(diǎn)，負(fù)責(zé)向T細(xì)胞傳遞激活信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞分化、增殖為效應(yīng)細(xì)胞；CTLA-4屬于共抑制性（co-inhibitory）免疫檢查點(diǎn)，負(fù)責(zé)向T細(xì)胞傳遞抑制信號(hào)，抑制T細(xì)胞的活性。特別的是，CTLA-4與CD80/CD86的親和力更高，可競(jìng)爭(zhēng)和阻斷CD28對(duì)T細(xì)胞的激活作用（圖1）。除此之外，與共抑制性免疫檢查點(diǎn)PD-1不同（腫瘤細(xì)胞會(huì)通過高表達(dá)其配體PD-L1和PD-L2來實(shí)現(xiàn)免疫逃逸），CTLA-4的配體CD80/CD86主要表達(dá)在APC表面，而在多數(shù)的腫瘤組織及細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)。

圖1. CTLA-4是一種跨膜蛋白[1]，它與CD28有相同的配體CD80（B7-1）和CD86（B7-2）。CTLA-4與CD80/CD86的親和力更高，可競(jìng)爭(zhēng)和阻斷CD28和其配體的結(jié)合，從而抑制CD28對(duì)T細(xì)胞的激活作用。

作為一個(gè)經(jīng)典的免疫檢查點(diǎn)蛋白，靶向CTLA-4的抗體藥物研究十分熱門。但是，目前美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的CTLA-4免疫檢查點(diǎn)抑制劑只有一種：Ipilimumab（伊匹單抗，商品名Yervoy，也稱為Y藥），由百時(shí)美施貴寶（Bristol-Myers Squibb，BMS）公司研發(fā)，用于治療晚期轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。

此外，值得一提的是目前還有一款由阿斯利康（AstraZeneca）公司研發(fā)的靶向CTLA-4的候選藥物：Tremelimumab（替西木單抗）。這款候選藥物的臨床研究進(jìn)展異常曲折：2015年由FDA授予治療惡性間皮瘤（malignant mesothelioma，MM）的孤兒藥地位；2017年宣布III期臨床研究MYSTIC失��；2019年宣布III期臨床研究NEPTUNE失敗；2020年2月又由FDA授予治療肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）的孤兒藥資格; 同年3月又宣布另一項(xiàng)III期臨床研究DANUBE失敗。由衷希望2021年能聽到一些好消息，為腫瘤患者們帶來新希望。

除此以外，近期，目前流行的CTLA-4免疫抑制劑作用機(jī)制也受到了挑戰(zhàn)（圖2）。2018年，美國(guó)馬里蘭大學(xué)的Yang Liu教授和Zheng Pan教授團(tuán)隊(duì)提出質(zhì)疑[2]： 抗CTLA-4抗體可能是通過由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用（Antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）或由NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴的細(xì)胞毒性（Antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）來選擇性的清除腫瘤細(xì)胞中的免疫抑制性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（圖3）。

圖2. 目前流行的CTLA-4免疫抑制劑作用機(jī)制：阻斷CTLA-4免疫檢查點(diǎn)導(dǎo)致了抗腫瘤免疫效果。T細(xì)胞活化需要雙重信號(hào)。信號(hào)1來源于APC上的抗原-MHC復(fù)合物與T細(xì)胞上的TCR結(jié)合；信號(hào)2來源于APC上的B7分子（CD80或CD86）與T細(xì)胞上的共刺激性受體CD28結(jié)合�；罨�的T細(xì)胞上調(diào)其細(xì)胞表面CTLA-4的表達(dá)。而共抑制性受體CTLA-4與CD80/CD86的親和力更強(qiáng)，它與CD28競(jìng)爭(zhēng)配體CD80/CD86，并抑制T細(xì)胞的活性，為T細(xì)胞的激活踩下“剎車”。抗CTLA-4抗體被認(rèn)為松開了對(duì)初始T細(xì)胞的“剎車”，并準(zhǔn)許它們?cè)诹馨徒Y(jié)中被激活，然后遷移到腫瘤部位對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。

圖3. 新的CTLA-4免疫抑制劑作用機(jī)制：選擇性清除腫瘤微環(huán)境中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）導(dǎo)致了抗腫瘤免疫效果。腫瘤中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)高水平的CTLA-4蛋白，因此抗CTLA-4抗體可能是通過由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用（Antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）或由NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴的細(xì)胞毒性（Antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）來選擇性的清除這些Treg。阻斷CTLA-4與其配體CD80/CD86的結(jié)合對(duì)有效清除腫瘤中的Treg來說并不是必需的。

綜上，CTLA-4蛋白在抑制T細(xì)胞活性中具有重要作用，針對(duì)它的免疫抑制劑是目前上市的三類免疫檢查點(diǎn)抑制劑之一（另外兩類是PD-1和PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑）。此外，這些藥物還在不斷擴(kuò)大其適應(yīng)癥，并與其他腫瘤免疫藥物進(jìn)行聯(lián)用以提高療效（例如CTLA-4抗體與PD-1抗體聯(lián)合免疫療法、CTLA-4抗體與以IL-13Rα2為靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞聯(lián)合免疫療法），但關(guān)于CTLA-4免疫抑制劑的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] https://pdb101.rcsb.org/learn/structural-biology-highlights/tuning-immune-response-with-costimulation.

[2] Tang F., et al. Anti-CTLA-4 antibodies in cancer immunotherapy: selective depletion of intratumoral regulatory T cells or checkpoint blockade? Cell & Bioscience 8: 30 (2018).

賽業(yè)生物CTLA-4人源化小鼠，助力腫瘤研究

品系背景：C57BL/6N

品系構(gòu)建策略：

在小鼠基因組上的Ctla-4基因位點(diǎn)敲入人源CTLA-4胞外區(qū)域編碼序列，使其能夠表達(dá)：a）嵌合型Ctla-4蛋白（人源胞外結(jié)構(gòu)域和鼠源胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域）和b）可溶性嵌合體蛋白（人源胞外結(jié)構(gòu)域）。

品系說明：

• CTLA-4基因的胞外域完全被人源化。
• hCTLA-4在小鼠體內(nèi)表達(dá)具有正常的生理表達(dá)和調(diào)節(jié)模式。
• 保留了小鼠CTLA-4胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，保證了正常的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
• 小鼠的免疫系統(tǒng)功能健全。
• 缺乏小鼠靶基因的表達(dá)，從而避免交叉反應(yīng)。

研究應(yīng)用：

hCTLA-4小鼠能夠在完全具有免疫能力的小鼠中進(jìn)行針對(duì)人類免疫檢查點(diǎn)CTLA-4的免疫腫瘤學(xué)藥物的體內(nèi)療效評(píng)估和分析。您也可以委托賽業(yè)生物構(gòu)建條件性基因敲除CTLA-4小鼠對(duì)藥物的靶向性和毒性進(jìn)行組織特異性評(píng)估。

模型驗(yàn)證：

圖4. CTLA-4小鼠中各類免疫細(xì)胞（T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞、單核細(xì)胞）與WT小鼠的各類免疫細(xì)胞的比例接近，小鼠免疫細(xì)胞功能正常。

圖5. hCTLA-4的功能：α-human CTLA-4單抗下調(diào)，hCTLA-4小鼠Treg對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的抑制。

用CFSE標(biāo)記分離的CD4⁺CD25^-T細(xì)胞（效應(yīng)T細(xì)胞），并用可溶性αmCD3和APC ^+/-（CD4⁺CD25⁺）Treg和CTLA-4抗體激活。（A）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CFSE稀釋；（B）通過ELISA在上清液中測(cè)定IL-2的產(chǎn)生。

圖6. hCTLA-4在hCTLA-4小鼠體內(nèi)的表達(dá)模式與野生型小鼠中mCTLA-4的表達(dá)模式一致。

hCTLA-4和mCTLA-4在αCD3活化的脾細(xì)胞表達(dá)情況。hCTLA-4小鼠模型和野生型小鼠上表達(dá)的（A）Treg亞群（CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺)，（B）傳統(tǒng)CD4⁺（CD3⁺CD4⁺）和（C）CD8⁺（CD3⁺CD8⁺）T細(xì)胞。

圖7. 在CTLA-4人源化小鼠中，CTLA-4單抗（Ipilimumab）具有抗腫瘤活性。

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