NASH小鼠模型助力非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制的研究

非酒精性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）是由營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩引起的肝脂肪變性和慢性炎癥導(dǎo)致的肝臟代謝性疾病，會(huì)逐步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌，目前尚未有批準(zhǔn)用于NASH治療的藥物。近來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)激活A(yù)MPK通路，蟲(chóng)草素能抑制肝臟脂肪堆積，防止肝臟炎癥損傷和纖維化的發(fā)生。該研究成果于2021年2月發(fā)表在Hepatology (IF=14.679，Q1) 雜志上。

蟲(chóng)草素（Cordycepin）是蟲(chóng)草的主要活性成分，具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗脂肪生成和抗腫瘤等。然而，蟲(chóng)草素對(duì)NASH進(jìn)展的作用以及其中的潛在機(jī)制還不明確。因此，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)高脂飲食（HFD）和高脂高膽固醇飲食（HFHC）喂養(yǎng)建立NASH小鼠模型（這兩種模型涵蓋了人類NASH的代謝特征），探究蟲(chóng)草素對(duì)NASH發(fā)生發(fā)展的影響。

蟲(chóng)草素可減輕棕櫚酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積、炎癥和脂毒性

為研究蟲(chóng)草素對(duì)代謝應(yīng)激下肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積和炎癥的影響，通過(guò)混合脂肪酸PO（棕櫚酸，PA和油酸，OA）刺激LO2細(xì)胞。結(jié)果表明蟲(chóng)草素有效降低了細(xì)胞內(nèi)的脂滴蓄積、甘油三酯（TG）和血清總膽固醇 （TC）含量、脂肪酸合成（FASN、SCD1、ACCα、PPARγ）和炎癥（IL-6、TNFα、CCL5、CXCL10）相關(guān)基因的表達(dá)。為系統(tǒng)地評(píng)價(jià)蟲(chóng)草素對(duì)肝細(xì)胞的影響，進(jìn)行了肝細(xì)胞RNA-Seq分析，結(jié)果表明組間的差異基因顯著富集于炎癥、脂代謝和凋亡相關(guān)通路，而且蟲(chóng)草素能夠顯著下調(diào)富集在上述通路的差異基因的表達(dá)。

圖1. 蟲(chóng)草素對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和炎癥的影響。

蟲(chóng)草素可減輕高脂飲食引起的肝脂肪變性和炎癥

探究蟲(chóng)草素能否減輕HFD引起的小鼠NASH疾�。ㄐ坌訡57BL/6J小鼠HFD喂養(yǎng)共24周）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蟲(chóng)草素顯著降低了HFD引起的肝指數(shù)升高、肝臟脂質(zhì)（TG、TC）含量增加、肝臟病理?yè)p傷（脂質(zhì)蓄積、氣球樣變、炎性浸潤(rùn)）、脂肪酸合成攝取和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。

蟲(chóng)草素可改善HFHC飲食引起的肝脂肪變性、炎癥和纖維化

為進(jìn)一步研究蟲(chóng)草素對(duì)NASH的體內(nèi)保護(hù)作用，建立高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH模型（雄性C57BL/6J小鼠HFHC喂養(yǎng)共16周），該模型比HFD誘導(dǎo)的模型表現(xiàn)出更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和纖維化特征。結(jié)果表明，蟲(chóng)草素顯著降低了HFHC引起的肝指數(shù)升高，肝臟脂質(zhì)（TG、TC）含量增加，肝臟病理?yè)p傷（脂質(zhì)蓄積、氣球樣變、炎性浸潤(rùn)和纖維化），脂代謝、炎癥反應(yīng)和纖維化相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。

圖2. 蟲(chóng)草素對(duì)HFHC誘導(dǎo)NASH小鼠的肝脂肪變性、炎癥和纖維化的影響。

代謝應(yīng)激時(shí)，蟲(chóng)草素能激活肝細(xì)胞和小鼠肝臟的AMPK信號(hào)

為進(jìn)一步探究蟲(chóng)草素對(duì)NASH的保護(hù)機(jī)制，對(duì)細(xì)胞和小鼠的RNA-Seq結(jié)果進(jìn)行了通路富集，發(fā)現(xiàn)差異基因均主要集中在脂代謝、炎癥、纖維化和凋亡途徑，其中蟲(chóng)草素對(duì)AMPK通路的影響優(yōu)于其他信號(hào)通路。通過(guò)多組學(xué)（轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)）分析表明，AMPK通路與脂代謝、炎癥、纖維化和凋亡靶點(diǎn)顯著相關(guān)，可能是蟲(chóng)草素作用的關(guān)建通路。為確定蟲(chóng)草素抗NASH是否通過(guò)AMPK途徑，研究者測(cè)定了細(xì)胞中、HFD和HFHC分別誘導(dǎo)的小鼠肝臟中AMPK通路中蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)草素顯著激活了AMPK及其下游ACC蛋白的磷酸化。

圖3. 轉(zhuǎn)錄組和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析：AMPK途徑可能是蟲(chóng)草素的靶標(biāo)。

抑制AMPK磷酸化，能消除蟲(chóng)草素介導(dǎo)脂毒性肝細(xì)胞和HFD誘導(dǎo)NASH小鼠的脂質(zhì)蓄積和炎癥抑制

為進(jìn)一步研究AMPK在蟲(chóng)草素抗NASH中的關(guān)鍵作用，研究人員構(gòu)建了AMPK敲除的LO2細(xì)胞。結(jié)果表明，在AMPK-KO LO2細(xì)胞中，蟲(chóng)草素對(duì)AMPK通路的激活和脂質(zhì)積累的抑制作用基本消失。同時(shí)，對(duì)LO2細(xì)胞和HFD喂食小鼠給予AMPK抑制劑Compound C，結(jié)果表明Compound C完全消除了蟲(chóng)草素對(duì)細(xì)胞和小鼠的保護(hù)作用。總的來(lái)說(shuō)，蟲(chóng)草素主要通過(guò)激活A(yù)MPKα介導(dǎo)的降脂、抗炎和抗纖維化來(lái)發(fā)揮其抗NASH的作用。

圖4. LO2細(xì)胞敲除AMPK后，蟲(chóng)草素對(duì)細(xì)胞脂代謝的影響。

圖5. 給予AMPK抑制劑后，蟲(chóng)草素對(duì)細(xì)胞和小鼠脂肪變性和炎癥的影響。

綜上所述，本研究使用HFD和HFHC飲食分別誘導(dǎo)的NASH小鼠模型證明了蟲(chóng)草素抗NASH的藥效作用，同時(shí)使用了AMPK基因敲除細(xì)胞和AMPK抑制劑處理的細(xì)胞和小鼠闡明了蟲(chóng)草素抗NASH的作用機(jī)制。在這項(xiàng)研究中，研究者們發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)草素可能是一種AMPKα抑制劑，通過(guò)激活A(yù)MPK途徑，減輕肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化，從而抑制非酒精性脂肪肝炎的發(fā)生。

非酒精性脂肪性肝�。∟AFLD）是一種無(wú)酒精濫用的肝病綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬變。可從單純性脂肪肝經(jīng)非酒精性脂肪性肝炎（NASH）發(fā)展為肝纖維化，甚至導(dǎo)致肝硬化、肝細(xì)胞癌（HCC）或肝功能衰竭等終末期肝病。動(dòng)物模型在闡明非酒精性脂肪肝的病理生理機(jī)制以及新藥的開(kāi)發(fā)中起著重要的作用。臨床前研究需要根據(jù)研究的特定NAFLD表型使用不同的動(dòng)物模型。NAFLD和NASH的臨床前動(dòng)物模型可分為四類：飲食誘導(dǎo)模型、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)模型、基因編輯模型、復(fù)合模型。

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