小鼠疾病模型構(gòu)建與藥物臨床前評(píng)價(jià)研究的思考

許多人類(lèi)疾病的發(fā)生與基因突變直接相關(guān)，研究表明，有超過(guò)15000基因突變與腫瘤、代謝、神經(jīng)和心血管等疾病發(fā)生有關(guān)。另外，目前已報(bào)道的罕見(jiàn)�。ㄒ卜Q(chēng)孤兒�。┏�過(guò)7,000多種，且有超過(guò)80%與基因突變密切相關(guān)。遺傳性罕見(jiàn)病已經(jīng)影響到超過(guò)3.5億人群，且多為兒童(～50%)。這類(lèi)疾病通常嚴(yán)重、臨床診斷與治療多復(fù)雜、且多呈慢性發(fā)展。目前絕大多數(shù)遺傳罕見(jiàn)�。ā�95%）仍無(wú)有效治療方法。另外，與傳統(tǒng)藥物研發(fā)投入比較，遺傳性罕見(jiàn)疾病藥物研發(fā)投入相對(duì)較少。因此，針對(duì)遺傳性疾病治療方法及藥物研發(fā)已成為當(dāng)前科學(xué)家們與生物制藥行業(yè)積極關(guān)注的研究領(lǐng)域。然而，由于這類(lèi)遺傳性罕見(jiàn)病的患者人數(shù)少，不利于藥物（孤兒藥）研發(fā)的臨床試驗(yàn)研究開(kāi)展，也成為此類(lèi)藥物研發(fā)面臨的特殊挑戰(zhàn)。

小鼠模型在模式生物中所具有的獨(dú)特綜合優(yōu)勢(shì)，不僅表現(xiàn)在遺傳學(xué)與生理學(xué)上與人具有相似性，也有其成本低、繁殖飼養(yǎng)快速方便、遺傳背景明確、以及相應(yīng)基因編輯技術(shù)成熟等有利因素，使其成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究，包括基因功能及致病過(guò)程、建立人相關(guān)疾病模型和藥物臨床前評(píng)價(jià)研究等最為重要的模式動(dòng)物。通過(guò)小鼠疾病模型的構(gòu)建，有助于我們深入揭示潛在致病基因作用機(jī)制，為藥物臨床前評(píng)價(jià)研究提供工具，成為由藥物研發(fā)基礎(chǔ)研究向臨床疾病治療應(yīng)用有效轉(zhuǎn)化的重要橋梁。

小鼠疾病模型有助于遺傳性疾病致病基因的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證

在此，借用周斌教授2020年發(fā)表的成功研究案例，簡(jiǎn)要說(shuō)明小鼠疾病模型應(yīng)用于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的思路與策略，該研究從臨床患者中篩選到潛在的致病基因，通過(guò)相應(yīng)基因編輯技術(shù)，構(gòu)建能與人相關(guān)疾病病理表型關(guān)聯(lián)的小鼠疾病模型，并將其與人疾病病理癥狀特征與相關(guān)基因聯(lián)系起來(lái)，達(dá)到驗(yàn)證與揭示潛在致病基因在誘發(fā)疾病表型過(guò)程的作用機(jī)制。

作者首先從家族性高膽固醇血糖臨床患者人群中，篩查到低密度脂蛋白受體（LDLR）未知新突變E207X，且體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，表達(dá)突變LDLR基因與其功能改變具有相關(guān)性。為了進(jìn)一步在體內(nèi)證實(shí)該LDLR基因突變與高膽固醇血癥/動(dòng)物粥樣硬化的因果關(guān)系，賽業(yè)生物應(yīng)用CRISPR/Cas9基本編輯技術(shù)，為作者專(zhuān)門(mén)定制了Ldlr-E208X（對(duì)應(yīng)人LDLR-E207X）點(diǎn)突變小鼠模型。研究結(jié)果表明，該Ldlr-E208X點(diǎn)突變小鼠模型在高脂飲食誘導(dǎo)下，表現(xiàn)與臨床患者相似的高膽固醇血癥及動(dòng)脈粥樣硬化表型，從而建立了模擬家族性人膽固醇血癥及動(dòng)脈粥樣硬化患者的小鼠疾病模型，為進(jìn)一步探索該疾病基因療法的臨床前評(píng)價(jià)研究提供了可能。

作者在Ldlr-E208X點(diǎn)突變小鼠疾病模型基礎(chǔ)上，驗(yàn)證基因編輯修正療法治療該疾病的可能性與效果。通過(guò)將構(gòu)建的AAV8載體介導(dǎo)CRISPR/Cas9編輯基因治療技術(shù)注射到突變小鼠肝臟，觀察小鼠體內(nèi)正常Ldlr蛋白表達(dá)水平及其相關(guān)表型變化，結(jié)果表明，Ldlr蛋白表達(dá)不僅獲得一定程度恢復(fù)，且其原有的高膽固醇血癥及動(dòng)脈粥樣硬化表型，也都獲得一定程度的改善。

小鼠疾病模型研究也是人相關(guān)疾病藥物研發(fā)的起點(diǎn)

早期階段科學(xué)假說(shuō)與疾病潛在藥物治療效果評(píng)價(jià)，始于小鼠疾病模型構(gòu)建及其實(shí)驗(yàn)室研究。CRISPR編輯技術(shù)的誕生與發(fā)展，使得構(gòu)建基因編輯小鼠疾病模型模擬人相關(guān)疾病更加簡(jiǎn)便有效。小鼠疾病模型在研究遺傳性相關(guān)疾病，比如脊髓性肌萎縮癥（SMA）、遺傳性視網(wǎng)膜疾病（IRD）、阿尓滋海默癥（AD）致病機(jī)制與潛在藥物的臨床前研發(fā)中發(fā)揮了積極的促進(jìn)作用。

2019年，由諾華研發(fā)的治療脊髓性肌萎縮癥（SMA）嬰兒患者的基因療法（Zolgensma），獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。該藥成為首款獲批上市的一次性基因治療方案（定價(jià)212.5萬(wàn)美元），也是目前最貴的一個(gè)基因替代治療的突破性療法，因而具有里程碑意義。

應(yīng)用SMN基因敲除小鼠，研究SMA早期基因治療效果表明，對(duì)SMN敲除小鼠出生后一天，進(jìn)行scAAV9-SMN基因治療，可明顯改善SMA小鼠神經(jīng)肌肉生理學(xué)、運(yùn)動(dòng)功能障礙及存活時(shí)間。而對(duì)出生后5天和10天后小鼠進(jìn)行相同注射治療，效果則隨之明顯下降。提示基因治療時(shí)間的早晚與其治療效果密切相關(guān)。

眼睛被公認(rèn)為是基因治療的理想靶器官

(1) 眼睛有緊密血視網(wǎng)膜屏障(BRB)，使視網(wǎng)膜成為相對(duì)免疫特權(quán)組織。對(duì)于外來(lái)抗原(比如病毒載體)具有耐受性，不會(huì)引起嚴(yán)重免疫炎癥反應(yīng)；

(2) 眼睛局部注射病毒載體，引起病毒廣泛擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)也很低，降低了可能出現(xiàn)的全身副反應(yīng)發(fā)生；

(3) 眼睛器官組織小，需要病毒載體量也相對(duì)少，降低了潛在毒副作用；

(4) 眼睛部位手術(shù)相對(duì)容易操作，便于實(shí)施玻璃體內(nèi)和視網(wǎng)膜下注射病毒載體，達(dá)到治療靶區(qū)域；

(5) 視網(wǎng)膜細(xì)胞為分化和非分裂細(xì)胞，即使用非整合載體（比如AAV），也不用擔(dān)心轉(zhuǎn)基因的丟失；

(6) 用非侵入方法，可較易檢測(cè)基因治療后，視力功能及視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)等變化；

(7) 典型遺傳性視網(wǎng)膜疾病為雙側(cè)對(duì)稱(chēng)性變性，易于設(shè)置治療對(duì)照。

先天性黑矇（LCA）是基因治療眼科疾病的理想選擇

相對(duì)與光感（PR）細(xì)胞而言，RPE65基因表達(dá)位于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）層，因而更加便于AAV載體發(fā)揮其有效作用。另外，RPE65基因缺失導(dǎo)致的嚴(yán)重視力減退過(guò)程，發(fā)生于20～30年間，并維持相對(duì)保守的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化。這也為基因治療發(fā)揮其恢復(fù)視力功能提供了較好機(jī)會(huì)。2017年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了Spark公司AAV-RPE65基因療法（Luxturna），達(dá)到恢復(fù)與改善先天性黑矇（LCA）患者視力作用。該療法售價(jià)高達(dá)75萬(wàn)美元/一只眼(150萬(wàn)/患者)。

通過(guò)構(gòu)建Rpe65基因敲除小鼠模型，建立先天性黑矇(LCA)小鼠疾病模型的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠視錐光傳導(dǎo)特異性相關(guān)基因表達(dá)顯著降低，引起小鼠早期視錐細(xì)胞損失，使光感細(xì)胞平衡狀態(tài)破壞，導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡。注射9-或11-順式視黃醛至2周齡Rpe65敲除小鼠，可增加該小鼠注射區(qū)域視錐細(xì)胞數(shù)密度2倍。提示缺乏順式視黃醛可能參與早期視錐細(xì)胞衰退變性過(guò)程。

針對(duì)遺傳性疾病基因治療的主要策略

1. DNA基因替代/增加療法：導(dǎo)入新基因取代突變基因。但對(duì)于顯性突變情況，抑制突變基因活性，則是需要首先考慮的治療策略。

2. CRISPR/Cas9基因編輯療法：兩種治療策略，包括直接在體內(nèi)修改突變基因，或者通過(guò)體外修改患者來(lái)源的相關(guān)細(xì)胞，再回輸編輯后細(xì)胞至治療部位保護(hù)。主要的挑戰(zhàn)：如何增加非分裂細(xì)胞基因組重組修復(fù)效率，因?yàn)榇祟?lèi)細(xì)胞多缺乏HDR機(jī)制。

3. RNA基因治療方法：不需要將基因傳送至細(xì)胞核，大大降低基因整合至宿主基因組風(fēng)險(xiǎn)的優(yōu)勢(shì)。治療策略包括RNA剪切修飾、轉(zhuǎn)錄后基因剪切和RNA編輯等。主要挑戰(zhàn)：降低mRNA傳送過(guò)程可能引起的免疫原性，以及提高其穩(wěn)定性。

重組AAV病毒載體

基因治療的發(fā)展給罕見(jiàn)病的治療帶來(lái)了希望。不過(guò)真正在人身上的治療開(kāi)始之前，需要有大量的臨床前科研工作為其奠定基礎(chǔ)。其中就包括了載體的選擇，治療策略的確定等。目前如果是體內(nèi)的基因治療，腺相關(guān)病毒無(wú)疑占據(jù)著統(tǒng)治地位。重組AAV病毒載體則是目前基因治療最為常用的病毒載體。

優(yōu)點(diǎn)：通常不會(huì)引起明顯的免疫反應(yīng)，也不會(huì)融入到宿主基因組，能夠在啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。

缺點(diǎn)：因?yàn)椴徽�合到�?xì)胞DNA中，當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，就會(huì)丟失。

AAV載體包括兩種類(lèi)型：單鏈AAV (ssAAV)和自我互補(bǔ)AAV (scAAV)載體。當(dāng)細(xì)胞被ssAAV傳導(dǎo)后，單鏈病毒DNA需要先轉(zhuǎn)化為雙鏈形式，這是限速步驟，成為不利因素。scAAV載體病毒感染細(xì)胞后，立即以自我互補(bǔ)方式，形成雙鏈DNA，加速病毒復(fù)制及基因表達(dá)過(guò)程，提升了效率。但scAAV載體包裝容量只是ssAAV載體的一半(～2.4kb) 。到目前為止，已經(jīng)在人和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)與鑒定有超過(guò)12個(gè)（約100個(gè)變異體）AAV載體。其中血清型2、5、7、8和9為目前較為常用的AAV病毒載體。

下期內(nèi)容預(yù)告：中篇我們將講述小鼠疾病模型在藥物臨床前評(píng)價(jià)研究中面臨的挑戰(zhàn)，敬請(qǐng)期待~

賽業(yè)生物一站式服務(wù)平臺(tái)助力基因治療研究

作為一家基于模式動(dòng)物的國(guó)際化創(chuàng)新性CRO平臺(tái)，賽業(yè)生物深知罕見(jiàn)病是全人類(lèi)共同面臨的公共健康問(wèn)題，并希望通過(guò)自己在專(zhuān)業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)專(zhuān)長(zhǎng)助力罕見(jiàn)病基因治療研究。為此，賽業(yè)生物啟動(dòng)了“罕見(jiàn)病基因解碼計(jì)劃”，致力于完善罕見(jiàn)病致病基因數(shù)據(jù)，結(jié)合賽業(yè)生物強(qiáng)大的生物大數(shù)據(jù)分析平臺(tái)及一站式小鼠模型服務(wù)平臺(tái)和全球客戶(hù)共同開(kāi)發(fā)罕見(jiàn)病模型，支持罕見(jiàn)疾病藥物研發(fā)。

賽業(yè)生物過(guò)去十年來(lái)，已為數(shù)百課題組提供了數(shù)百種用以驗(yàn)證基因治療療法的基因編輯模式動(dòng)物和病毒包裝服務(wù)。賽業(yè)產(chǎn)品和服務(wù)引用文獻(xiàn)總數(shù)超5200篇，其中不乏Nature、Cell、Science等頂級(jí)期刊。

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