無菌小鼠模型在微生物組學(xué)中的應(yīng)用

疾病動物模型是研究人類疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制、藥物篩選及療效評價(jià)必不可少的工具，好的疾病動物模型可以加快新藥的研發(fā)速度。你還在為不知道選擇什么小鼠模型發(fā)愁嗎？你還在為造模發(fā)愁嗎？賽業(yè)生物新欄目《每周一鼠》，每周更新，為大家講解一個(gè)疾病小鼠模型的故事，希望對大家了解不同的疾病小鼠模型有所幫助。今天和大家見面的是無菌鼠。

隨著基因組學(xué)、代謝組學(xué)等高通量檢測技術(shù)的應(yīng)用，人們逐漸認(rèn)識到胃腸道微生物群存在巨大遺傳多樣性和代謝復(fù)雜性。這些共生細(xì)菌通過與宿主的復(fù)雜交互作用調(diào)節(jié)胃腸道的發(fā)育和功能，與營養(yǎng)代謝、腫瘤、免疫、衰老等多種生理或病理狀態(tài)密切相關(guān)。在人體微生物組學(xué)中，96-99%的微生物聚集在胃腸道，同時(shí)也是研究領(lǐng)域的重點(diǎn)方向，并且從2011年開始，微生物研究成果屢上十大科學(xué)突破榜。但由于體內(nèi)微生物群體組成和作用的網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，且每一個(gè)自然個(gè)體體內(nèi)的微生物組成都不完全相同，使得其研究十分困難。因此需要一種理想的模型來探索微生物與宿主的作用及相關(guān)機(jī)制，而無菌動物就是理想的模型。

無菌動物的發(fā)展史

1885年，路易斯·巴斯德即提出生命依賴于微生物的定殖，并嘗試研究宿主與微生物的相互作用。為測試動物宿主能否在無菌（germfree, GF）狀態(tài)下生存，Nuttal和Thierfelder首次在無菌條件下飼養(yǎng)豚鼠。這種無菌豚鼠外觀健康，并于第8天處死，其腸內(nèi)容物沒有檢出細(xì)菌。同時(shí)此次試驗(yàn)也觀察到了一些顯著的表型差異，例如盲腸增大（常規(guī)體積的五倍）。其盲腸中充滿了“一種含奶酪塊樣物質(zhì)的棕色液體”。研究表明這些盲腸內(nèi)容物中含有毒性生物活性物質(zhì)，可導(dǎo)致平滑肌收縮能力的改變。這種無菌動物模型在生理和生化方面也表現(xiàn)出一定的異常表型，如免疫系統(tǒng)功能改變，輕度慢性腹瀉，代謝紊亂，生殖能力降低等[1]。

圖1. 12周齡的無菌Swiss Webster雌鼠和常規(guī)飼養(yǎng)小鼠的腹腔臟器比較（*表示盲腸）

20世紀(jì)中期前，受技術(shù)限制，飼養(yǎng)健康的無菌動物一直是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。20世紀(jì)40年代中期至50年代初，Reyniers等創(chuàng)造了不銹鋼制的無菌動物大型隔離器，使無菌動物的研究逐漸系統(tǒng)化。20世紀(jì)50年代末，研究人員已掌握無菌類動物模型的飼養(yǎng)技術(shù)，成功飼養(yǎng)無菌豚鼠、小鼠和雞。此后研究人員開始將無菌動物與傳統(tǒng)飼養(yǎng)的動物進(jìn)行比較研究，通過一次引入一種或幾種微生物菌種，探究宿主與微生物的相互作用[2]。借助這些無菌動物模型，科學(xué)家們逐漸揭示了微生物-微生物相互作用、基因-微生物相互作用、飲食-微生物相互作用以及影響胃腸道微生物定殖的因素等。

無菌動物（小鼠）基本概念

無菌動物指現(xiàn)有檢測方法不能檢出任何活的微生物和寄生蟲的動物。“無菌”不是絕對的，只是依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)尚無法檢出已知的微生物和寄生蟲。即使是SPF級動物也難以排除自身攜帶潛在致病菌的可能，其體內(nèi)存在特異性抗體等免疫激活狀態(tài)，會對后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究產(chǎn)生潛在干擾，甚至影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判讀。無菌動物必須是采用特殊技術(shù)保證動物從出生后即無菌，需要在隔離系統(tǒng)繁育飼養(yǎng)，即在無菌條件下經(jīng)人工剖宮產(chǎn)獲得子代動物，再放入無菌隔離系統(tǒng)內(nèi)經(jīng)人工喂乳或無菌母體動物代乳喂養(yǎng)。在飼養(yǎng)繁育過程中，使用的飼料、飲水需經(jīng)過嚴(yán)格消毒，并通過定期檢測手段確保動物體內(nèi)外無一切微生物和寄生蟲。

無菌小鼠是目前研究宿主-微生物相互作用的重要動物模型，主要原因有三。首先，實(shí)驗(yàn)小鼠的基因型已得到很好的表征。其次，小鼠和人類基因組在功能上99%相似度。第三，轉(zhuǎn)基因小鼠不同于其他實(shí)驗(yàn)動物，它允許我們引入精確的基因修飾（如基因插入、敲除和修飾），允許我們在活體狀態(tài)下研究修飾基因的功能。將轉(zhuǎn)基因小鼠凈化繁育為無菌模型后，可進(jìn)一步了解環(huán)境和宿主基因?qū)ξ⑸�物群落的影響，以及微生物群落對宿主基因表達(dá)、表觀遺傳變化和宿主生理學(xué)的影響，作為構(gòu)建微生物靶向療法的臨床前模型。

無菌動物的特征

無菌動物由于飼養(yǎng)方法特殊，其結(jié)構(gòu)、功能與普通動物有很大區(qū)別，表現(xiàn)為：腸道肌層變薄、盲腸顯著肥大、腸粘膜絨毛增多、肝重量下降；血液系統(tǒng)中白細(xì)胞增加且數(shù)值恒定；單核-吞噬細(xì)胞功能降低，脾縮小，無三級濾泡；淋巴組織發(fā)育不良，產(chǎn)生抗體的能力很弱，對微生物感染異常敏感；腸上皮細(xì)胞更新率低，腸壁物質(zhì)交換較慢。

無菌飼育設(shè)施

無菌飼育設(shè)施在空間布局和人員安排方面需要專業(yè)基礎(chǔ)設(shè)施，包括但不限于適當(dāng)?shù)穆暺琳�、�?yīng)急電源和中心警報(bào)、高效過濾器進(jìn)氣口和正壓空間。在上述場地條件下，小鼠飼養(yǎng)于可調(diào)節(jié)的隔離裝置中，其溫度、濕度、壓力、氣流等因素能得到精確控制[3]。食物、水和其他用品必須用高壓滅菌裝置、輻照或消毒劑充分消毒，以滅活所有活微生物和寄生蟲，飼料中還需補(bǔ)充腸道細(xì)菌合成的營養(yǎng)成分。隨后將裝載上述物品的高壓滅菌桶經(jīng)轉(zhuǎn)移套筒送入隔離飼養(yǎng)室，轉(zhuǎn)移套筒傳送前須消毒滅菌。也可將其他方式滅菌的物品置于傳遞倉處，在送入隔離裝置前進(jìn)行消毒。類似方法也可用于隔離飼養(yǎng)室內(nèi)物品和樣本的取出。

圖2. 無菌小鼠的食物（上）、墊料（中）和飲水（下）依次通過封裝、貼消毒指示標(biāo)簽、進(jìn)入消毒桶消毒后才可進(jìn)入隔離室

根據(jù)不同使用目的，無菌小鼠可飼養(yǎng)在不同型號隔離器內(nèi)。一般大型隔離器可用于種群繁育或?qū)嶒?yàn)組只數(shù)較多的實(shí)驗(yàn)用途，較小的隔離器（容納4-5個(gè)籠子）中主要用于一般規(guī)模實(shí)驗(yàn)或重要品系保種。后者多數(shù)情況下可飼養(yǎng)一組的小鼠實(shí)驗(yàn)需求只數(shù)，相較前者，在有限空間內(nèi)可開展更多的實(shí)驗(yàn)。場地內(nèi)應(yīng)配專業(yè)技術(shù)人員，負(fù)責(zé)飼養(yǎng)設(shè)施的日常工作、定期維護(hù)和小鼠的繁育管理或?qū)嶒?yàn)操作。

圖3. 無菌鼠飼養(yǎng)設(shè)備。A）用于飼養(yǎng)無菌小鼠的隔離裝置；B）滅菌桶

凈化繁育

無菌動物在自然界中并不存在，只能依靠人工養(yǎng)育。一般將臨產(chǎn)前的健康動物用麻醉藥物或拉斷頸椎處死后，立即浸泡于37℃滅菌液中浸泡，隨后送進(jìn)無菌室（或無菌隔離器），通過無菌手術(shù)剖腹取出無菌狀態(tài)的帶胎子宮。將子宮浸入消毒液后再立即輸送至另一只隔離器中，切開子宮取胎。幼崽經(jīng)滅菌紗布擦拭并斷臍后放入隔離器內(nèi)人工喂乳或由其他無菌雌鼠代養(yǎng)。

無菌狀態(tài)的監(jiān)測

為確保無菌動物的無菌狀態(tài)，必須定期對小鼠生活標(biāo)本和糞便標(biāo)本進(jìn)行監(jiān)測。檢測方法包括培養(yǎng)法、革蘭氏染色和16srRNA檢測。此外，可送檢隔離包內(nèi)活體小鼠進(jìn)行監(jiān)測。

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參考文獻(xiàn)：

1. Mazmanian SK, Liu CH, Tzianabos AO, Kasper DL. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 2005;122(1):107-118.

2. Williams SC. Gnotobiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2014;111(5):1661.

3. Arvidsson C, Hallén A, Bäckhed F. Generating and Analyzing Germ-Free Mice. Current protocols in mouse biology. 2012;2(4):307-316.

4. Fontaine CA, Skorupski AM, Vowles CJ, Anderson NE, Poe SA, Eaton KA. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 2015;6(4):225-233.