基于非靶向的體內微生物代謝譜識別食品基質中的病原菌
發(fā)表期刊：Food Research International
影響因子：5.339
平臺：SPME/GC × GC- QTOF-MS
研究對象：微生物發(fā)酵液、空白發(fā)酵液、含菌食品（蝦、牛肉、豬肉和牛奶）、空白食品。
1.研究背景
目前，食源性病原菌是影響食品安全的首要因素，建立一種操作方便，有效實用的食源性病原體檢測方法顯得尤為重要。微生物揮發(fā)性有機物（MVOCs）檢測已經(jīng)成為揭示食品中病原菌腐敗和污染的一種新穎且有效的手段，但是，MVOCs種類繁多，受微生物種類、生長基質、環(huán)境條件等多種因素影響，導致了MVOCs濃度差異巨大。
本文采用的新型的全二維色譜技術和疏水-親水平衡固相微萃�。⊿PME）探針技術具有物質分離效果好，捕獲代謝物范圍廣的優(yōu)點。旨在通過對不同菌種的MVOCs檢測，尋找到不同微生物揮發(fā)性代謝標志物。從而建立一種食源性致病菌識別新方法。
2.研究思路
3.研究結果
1. 質譜方法優(yōu)化
本文的適用性驗證基于聚合物復合萃取探針，將該探針與三個商用萃取探針相比較，包括DVB /CAR/ PDMS(50/30μm), PDMS / DVB(65μm)和PDMS(75μm)。從提取的Shigella sonnei MVOCs的總峰面積來看1-1，新型SPME探針具有較大的峰面積，提取效果最好。結合定性比較結果，PDMS或CAR/PDMS對雙極性化合物(如醇和酮)的靈敏度較低。與DVB/CAR/ PDMS相比，新型SPME探針具有更高的保留能力，更適合于提取不同理化性質的MVOCs。因此，新型的SPME探針有助于提供更全面的MVOCs譜，為我們后續(xù)的實驗提供了有力的工具�？疾炝藲庀酄t升溫速率和萃取時間對萃取效果的影響。優(yōu)化結果如圖1-2，1-3所示。在初始溫度不變的條件下，以5℃ /min的加熱速率從50 ℃~ 230℃，對MVOCs的檢測靈敏度優(yōu)于其他加熱方案。同樣，為了獲得更好的提取效果，根據(jù)圖1-3中總峰面積隨提取時間的延長而增加的結果，選擇60 min作為最佳條件。
圖1 1-1SPME探針纖維（左）；1-2溫度程序（中）；1-3提取時間（右）
2. MVOCs的鑒定與分析
優(yōu)化后，將所建立的方法應用于5種食源性致病菌體內揮發(fā)性代謝產物的檢測，共鑒定出126種MVOCs為與細菌生長和代謝活性相關的優(yōu)勢代謝產物。圖2-C為五種食源性致病菌的MVOCs的PCA分析，顯示了它們之間響應性代謝特征的分離，并初步評價了實驗的重復性。不同菌株間鑒定的代謝物的主要化學類別如圖2-A所示。主要的基團是酯類、烴類、醇類、酮類，其次是吡嗪類。在傷寒沙門氏菌(55.56%)、金黃色葡萄球菌(26.32%)和大腸桿菌(24%)中檢出大量碳氫化合物。副溶血性弧菌中烴類含量較低(3.57%)。其中，桑內志賀氏菌(34.38%)和金黃色葡萄球菌(26.32%)的酯類含量特別高。酮和醇的比例相近，吡嗪的含量低于其他四種。圖2B為五種致病菌獨有和共享的揮發(fā)物的維恩圖。具體來說，所有被研究的細菌都共用十二烷。2,4-二叔丁基苯酚和2-乙基己醇由副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌共同擁有。此外，副溶血性弧菌與鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌共有2-十五烷酮、鄰苯二甲酸二異丁酯和鄰苯二甲酸二丁酯，與松內志賀氏菌和大腸桿菌共享1-辛醇和1-癸醇。金黃色葡萄球菌、志賀菌和大腸桿菌共享十八烷，前兩種菌共有2,5-二甲基-3-異戊基吡嗪和2-戊基呋喃，后兩種菌共有苯乙酮和3-苯基呋喃。痢疾志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌與十一烷共有，而桑氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌與2,6-二乙基吡嗪共有。大腸桿菌與溶血性弧菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌分別共有吲哚、環(huán)戊烷酮和2,5-二甲基吡嗪。副溶血性弧菌分別與鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌共有(z)-6-pentadecen-1-ol和二甲基三硫。
圖2 五種食源性病原體的主要化學類別的分布(A)；五種食源性病原體所釋放的獨特和共有的揮發(fā)性代謝物的維恩圖(B)；5種食源性致病菌MVOCs的PCA圖（C）
3. 微生物的代謝生物標志物圖譜
微生物的揮發(fā)性代謝產物深受培養(yǎng)基的影響，因此進一步分離和分析培養(yǎng)基與微生物之間的差異，對于尋找微生物獨特的代謝標志物具有重要意義。分別構建了5個OPLS-DA模型來區(qū)分5個研究純菌株及其無菌培養(yǎng)基的代謝產物譜。結果如圖3所示。然后用VIP值超過1作為卡值標準，結果如圖4所示。不考慮培養(yǎng)基的影響，多變量篩選得到22個差異代謝物。為了進一步明確有效的生物標記。在圖5中考慮了純培養(yǎng)基與菌株峰面積的比較。與無菌培養(yǎng)基相比，吲哚、2-十一烷、降植烷、2-己基呋喃、1-壬醇、丁基羥基甲苯、1-癸醇、3-甲基丁酸、2-十二烷酮、甲基-2,4-癸烯酸甲酯和2-十四烷酮的峰面積顯著增加。說明上述物質是菌株自身代謝的優(yōu)勢化合物。結合前人研究，五種食源性致病菌的潛在揮發(fā)性代謝標志物如下1-壬醇(志賀菌)、丁基羥基甲苯(志賀菌)、2-己基呋喃(志賀菌)、降植烷(鼠傷寒桿菌)、1-癸醇(大腸桿菌)、甲基-2,4-癸烯酸甲酯(金黃色葡萄球菌)、2-十二烷酮(金黃色葡萄球菌)、3-甲基丁酸(金黃色葡萄球菌)、以及2-十四酮(金黃色葡萄球菌)。吲哚是大腸桿菌和副溶血性弧菌共同擁有的潛在的揮發(fā)性標記物。
圖3 微生物培養(yǎng)體系與空白微生物培養(yǎng)基揮發(fā)性代謝物的OPLS-DA得分圖
圖4 通過OPLS-DA分析，得到5種致病菌的總化合物
圖5 菌株與無菌培養(yǎng)基差異變量的統(tǒng)計分析結果
4. 食品中五種致病菌潛在揮發(fā)性標記物的檢測
食物基質可能不同于肉湯培養(yǎng)系統(tǒng)。因此，通過實際食品樣本驗證新型SPME探針在病原細菌識別中發(fā)現(xiàn)的潛在揮發(fā)性標記物，以支持所建立方法的實用性。根據(jù)細菌宿主的實際情況，對蝦、牛肉、豬肉和牛奶三種食物基質進行了調查。分別測定了各細菌在相應的食物基質和培養(yǎng)基上生長的潛在揮發(fā)性標記物的峰面積，其產率隨時間的變化曲線如圖6所示。受污染的食品樣本中金黃色葡萄球菌的3-甲基丁酸和2-十一烷酮、大腸桿菌的吲哚和1-癸醇、副溶血性弧菌的吲哚和2-十一烷酮的信號強度先升高后降低。鼠傷寒沙門氏菌的降植烷和金黃色葡萄球菌的甲基-2,4-癸烯酸甲酯以及2-十四烷酮的信號強度逐漸升高。食物中致病菌代謝標志物濃度的變化與細菌在培養(yǎng)基中的生長趨勢一致。另外，上述化合物均未在實際樣品的對照組中檢測到。結果表明，食物基質中的微生物利用食物中豐富的營養(yǎng)物質進行自身生長繁殖，并繼續(xù)產生自己獨特的代謝產物。
圖6 分別在培養(yǎng)基和食物基質中培養(yǎng)的菌株潛在揮發(fā)性化合物的信號強度隨時間變化的結果:(A)大腸桿菌;(B)鼠傷寒沙門氏菌;(C)副溶血性弧菌;(D)桑氏志賀氏菌;(E)金黃色葡萄球菌。
4.結論
本研究成功地將新型SPME探針與GC×GC-Q-TOF-MS相結合，應用于五種食源性致病菌體內揮發(fā)性代謝物的檢測。通過多元統(tǒng)計分析，篩選出11個潛在的揮發(fā)性標記物，并在特定的食品基質中進行了驗證
本研究結果突出了體內揮發(fā)性代謝物作為食源性致病菌生長和代謝狀態(tài)指標的適用性，為微生物代謝組學的研究提供參考，該方法可為微生物識別提供一種簡單、高效、靈敏的替代方法。
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