生物保存：冷凍冷藏持續(xù)物理、生化和分子反應(yīng)對樣本質(zhì)量的影響

在生物應(yīng)用中，一個廣泛討論的話題是樣本冷凍過程和最終保存和儲存溫度對生物樣本穩(wěn)定性的影響。為了將生物材料保存在其最佳狀態(tài)，必須采用慢速冷凍過程，并將儲存溫度控制在絕對最低值。這些指南已得到普遍認(rèn)可，但這一過程背后的原理卻鮮少有人詳細(xì)闡述。本白皮書的目的是為這些操作的科學(xué)依據(jù)及其對生物材料生存能力的影響提供背景資料。

樣本儲存過程通常被稱為生物保存，由四個階段組成：制備、冷卻、儲存和解凍。這些階段通過“被稱為低溫連續(xù)介質(zhì)的細(xì)胞所經(jīng)歷的深化低溫應(yīng)激之旅”緊密相連，其中在一個階段中發(fā)生的事件會影響上下游的相鄰階段 1。生物保存的最終目的是將樣本置于生命暫停狀態(tài)，使其能夠在功能齊全的條件下恢復(fù)。這一過程對包括細(xì)胞、組織、細(xì)菌、病毒和分離的亞細(xì)胞成分（細(xì)胞器、DNA、 RNA、蛋白質(zhì)）在內(nèi)的各種樣本類型都非常有效，但也可能會產(chǎn)生一些負(fù)面影響。可分為兩類： 1) 物化-滲透壓和 2) 生化/分子^2,3。最終，如果下游分析顯示樣本質(zhì)量下降，則在解凍后可以觀察到這些作用產(chǎn)生的結(jié)果。在細(xì)胞或組織樣本中，這被視為產(chǎn)率或生存能力、功能、繁殖能力的降低以及遲發(fā)性凋亡和壞死誘導(dǎo)。在細(xì)菌、病毒、亞細(xì)胞器、 DNA、 RNA 或蛋白質(zhì)樣本中，數(shù)量、質(zhì)量、純度等的下降往往是次最優(yōu)生物保存的結(jié)果。

所有生物保存都需要將樣本的溫度從常溫（通常為 37 °C）降低到最終儲存溫度 1,3。在冷卻階段前，將樣本放入含有低溫保護(hù)劑（DMSO、甘油、乙二醇、糖等）的介質(zhì)中，并在大約 4 °C 下保持幾分鐘（<30 分鐘），以達(dá)到平衡。樣本冷卻在大約-1 °C/min的受控速率下完成，以實現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞的最佳保存 4。對于細(xì)菌、病毒和分離的亞細(xì)胞成分（細(xì)胞器、 DNA、 RNA 和蛋白質(zhì)），在受控速率下冷卻不會遇到太大的問題。在受控速率下冷卻減少體積偏移，并允許水流從細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境 4-7。這會導(dǎo)致細(xì)胞脫水和細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)（鹽、離子、低溫保護(hù)劑等）的冷凍濃縮，并降低胞內(nèi)冰形成的可能性。

細(xì)胞持續(xù)脫水，直到溫度降低到玻璃轉(zhuǎn)換溫度(Tg)以下，即樣本轉(zhuǎn)變?yōu)椴Ａ�態(tài)（純水的Tg 約為-135 °C） 8。
 

雖然細(xì)胞脫水對于降低胞內(nèi)冰形成的概率非常有利，但是當(dāng)樣本儲存在高于 Tg的溫度下時，脫水將在整個儲存期間持續(xù)進(jìn)行，造成更大的損傷。隨著樣本繼續(xù)脫水，會對細(xì)胞膜、細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和核酸造成結(jié)構(gòu)性損傷 1。這種損傷可能對樣本造成幾個方面的危害，包括激活延遲分子修復(fù)或降解途徑（凋亡、壞死、未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)、DNA 修復(fù)等），如果損傷過于嚴(yán)重，則可能會在解凍后立即導(dǎo)致樣本損耗⁹。

除了冷凍對樣本產(chǎn)生的物理影響，在分子層級上也會產(chǎn)生影響，這是由如下幾個因素造成的： 1)可用能量和代謝活動的減少； 2)生化途徑的解偶聯(lián)； 3)應(yīng)激反應(yīng)途徑的激活^9,10。在儲存過程中，在降低的動能水平下（降低 10 °C 相當(dāng)于可用熱能降低 3 %），溫度的降低會導(dǎo)致新陳代謝和生化途徑的減慢1。對于哺乳動物細(xì)胞，一個衡量新陳代謝總變化量平均值的簡單方法是 Q10，溫度每下降 10 °C（Q10為 2），新陳代謝（耗氧量）減少大約 50%^11,12。
 

本質(zhì)上，無論溫度如何，低溫儲存會減慢所有細(xì)胞的生化反應(yīng)，但不會停止，除非溫度低于 Tg。由于生物化學(xué)過程和途徑與溫度有關(guān)，即使在-20 °C 和-80 °C 下，生物化學(xué)反應(yīng)仍會發(fā)生，導(dǎo)致對樣本造成持續(xù)性損傷，無論是細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、 DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)菌還是病毒。這些反應(yīng)通常是不受控制和不完整的，會導(dǎo)致有毒中間化合物的形成和積累，例如自由基、厭氧代謝副產(chǎn)物以及由于必要的回收途徑或反應(yīng)所需的溫度抑制而無法清除的廢物。這些副產(chǎn)物可能會導(dǎo)致直接損傷或解凍后分子應(yīng)激反應(yīng)的激活¹⁰。使這一等式更加復(fù)雜的是，樣本所經(jīng)歷的許多應(yīng)激源在解凍時會引發(fā)分子死亡或生化降解級聯(lián)反應(yīng)，即使不會立即致死。這些因素包括代謝解偶聯(lián)、自由基生成、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和流動性的改變、細(xì)胞離子平衡失調(diào)、細(xì)胞內(nèi)鈣庫中鈣的釋放、滲透通量和低溫保護(hù)劑的暴露。例如，在儲存過程中自由基的生成和積累會直接損傷細(xì)胞和分離樣本中的 DNA、蛋白質(zhì)和線粒體的完整性 9,13,14。除了物理影響，自由基的積累還會激活 UPR 和凋亡途徑，導(dǎo)致樣本進(jìn)一步降解 15。在許多情況下，在生物保存過程中這些亞致死應(yīng)激源的積累會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的激活，隨后由于缺乏能量以及在解凍時應(yīng)激源的不斷“積聚”而發(fā)展為繼發(fā)性壞死。這種亞致死損傷的表現(xiàn)在解凍后可能不明顯，可能需要幾個小時到幾天的時間才能檢測到 2,3。
 

如上所述，儲存期間的損傷在物理和分子層級上持續(xù)發(fā)生。在物理上，樣本持續(xù)經(jīng)受由冷凍誘發(fā)的脫水和溶質(zhì)濃縮影響，造成持續(xù)和加深的損傷。在生物化學(xué)上，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，盡管速率大幅降低。在 Q10 為 2 的條件下，與 37 °C (100 %)時相比， 4 °C 時耗氧速率估計為 6 %， -20 °C 時為 1.6 %，-40 °C 時為 0.5 %， -70 °C 時為 0.05 %，-80 °C 時為 0.02 %。理論上講，這一過程將持續(xù)到 Tg 達(dá)到所有生化反應(yīng)停止為止。雖然大幅降低，在長期儲存期間這種生化活性仍較為顯著。例如，從能量和/或耗氧量計算的角度來看，在-80 °C 下儲存 40 天相當(dāng)于在 37 °C 下儲存 1 天（在-80 °C 下儲存 1 年相當(dāng)于在 37 °C 下儲存約 9 天）。應(yīng)注意，基于溫度的生化活性抑制并不普遍，因為各個途徑、過程和反應(yīng)的反應(yīng)各不相同 16。因此，雖然受到高度抑制，但生化過程仍在繼續(xù)，但以一種解偶聯(lián)和不受控制的方式進(jìn)行，從而導(dǎo)致樣本持續(xù)降解。隨著儲存溫度和間隔時間的增加，這些應(yīng)激事件會在樣本中放大。各個途徑、過程和反應(yīng)對長時間儲存的具體反應(yīng)還不清楚，但人們普遍認(rèn)為，儲存溫度對在發(fā)現(xiàn)明顯損傷之前的樣本儲存時間有著很大的影響 17,18。例如，在哺乳動物細(xì)胞中，在給定溫度下儲存時間的范圍為： 4 °C 下儲存不到一周； -20 °C 下不到一個月； -70 °C 和-80 °C 下不到 6-12 個月。儲存-196 ºC 的液氮中可有效防止所有熱驅(qū)動的化學(xué)反應(yīng)，只有電離輻射驅(qū)動的活動才能在該溫度下進(jìn)行。據(jù)估計，可能需要幾千年才能注意到對冷藏保存的培養(yǎng)基的可測量影響 19,20。根據(jù)報告，細(xì)菌、病毒、 DNA、 RNA 和蛋白質(zhì)樣本可在-80 °C 下儲存 1-2 年（或更長時間）。必須注意，這些保存時間僅供參考，單個樣本的保存時間應(yīng)通過檢查解凍后特定于預(yù)期最終用途的適當(dāng)參數(shù)確定。此外，這些儲存時間以最終溫度下的穩(wěn)定保存為基礎(chǔ)。在任何溫度下將任何樣本反復(fù)凍融都會導(dǎo)致樣本加速降解。
 

樣本對冷凍過程的持續(xù)物理、生化和分子反應(yīng)對其質(zhì)量有很大的影響。在細(xì)胞、細(xì)菌和病毒樣本中可以經(jīng)常觀察到產(chǎn)率、生存能力、功能和繁殖能力的降低，而 DNA、 RNA和蛋白質(zhì)樣本在數(shù)量、質(zhì)量和反應(yīng)性方面的下降是常見的。假設(shè)按照既定的方案解凍樣本，質(zhì)量下降是冷凍和儲存過程中應(yīng)激和降解的直接結(jié)果。由于樣本在儲存過程中不斷損傷，樣本儲存的時間越長，儲存溫度越高，樣本降解的程度就越大。如果樣本要長時間儲存，最好保存在最低可行的溫度下�？稍谝旱�中實現(xiàn)最佳儲存，即-196 ºC，此時所有生化反應(yīng)均停止�？紤]到在常規(guī)冷凍過程中所發(fā)生事件的復(fù)雜性，必須要了解樣本制備、冷卻、儲存溫度、儲存時間和加熱對樣本整體質(zhì)量的影響。要獲得在給定溫度下冷凍和儲存的好處，需要權(quán)衡單個樣本的最終儲存目標(biāo)（時間、最終用途、樣本復(fù)雜度等）。

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