慢病毒（LV）包裝的常見問題及解答（2）

慢病毒（Lentivirus，LV）是由人類免疫缺陷病毒（HIV）改造而來的一種病毒載體，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒。慢病毒可將特定基因片段隨機(jī)、穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的基因組中，實(shí)現(xiàn)目的基因的持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)目的產(chǎn)物，因此，目前慢病毒載體已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于基因的表達(dá)調(diào)控如過表達(dá)，干擾和基因敲除。

然而，在做病毒包裝實(shí)驗(yàn)中，科研工作者常遇到一些問題，賽業(yè)生物具有多年分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的研究經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞生物學(xué)產(chǎn)品經(jīng)理針對(duì)常見的問題整理了一份慢病毒包裝FAQ，希望能解答您關(guān)于慢病毒包裝的困惑，上篇回顧請(qǐng)點(diǎn)這里：慢病毒（LV）包裝的常見問題及解答。今天我們接著進(jìn)行慢病毒包裝常見的問題解答：

慢病毒載體最大可插入多大的片段？
慢病毒載體的載量為6-6.5kb左右，但一般建議插入的片段大小不超過5kb，這樣包裝出來的病毒滴度較高，若超過6kb則會(huì)顯著降低病毒滴度。實(shí)際病毒包裝中，我們常需要插入報(bào)告基因（如GFP）和抗性基因（如Puro），這使得目的片段的容量進(jìn)一步縮小至3kb左右。

我們目前通過載體優(yōu)化，例如刪去不必要的基因，減小啟動(dòng)子長(zhǎng)度，可使目的基因的片段容量擴(kuò)大到4kb左右。

怎么確認(rèn)我的細(xì)胞需要多少病毒量才夠？那么多規(guī)格我該怎么選？
由于慢病毒的感染譜很廣，可以感染分裂期和非分裂期的細(xì)胞，對(duì)于大部分的細(xì)胞類型，采用1×108 TU/ml的規(guī)格即可滿足要求，另外由于目前慢病毒多用于體外細(xì)胞的感染而少用于體內(nèi)注射，因此非純化亦可。

對(duì)于難感染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞，需要較高的MOI，需要的病毒量也較多，建議選高規(guī)格，如1×108 TU/ml。

對(duì)于較為少見的細(xì)胞類型所需要的病毒量，可通過參考文獻(xiàn)或預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

你們是用什么方法來檢測(cè)病毒滴度的？可靠嗎？
在上篇有講到，慢病毒滴度的測(cè)定方法主要有4種，即Elisa法檢測(cè)病毒顆粒中p24蛋白，PCR法檢測(cè)病毒顆粒RNA和檢測(cè)整合到基因組的病毒DNA，以及通過FACS檢測(cè)熒光蛋白的表達(dá)水平。

我們采用的是定量PCR檢測(cè)整合到細(xì)胞（293T）基因組中病毒DNA的方法，此方法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確。因?yàn)镋LISA和檢測(cè)病毒RNA的方法檢測(cè)的只是病毒顆粒的量，包括無活性的病毒顆粒，這會(huì)使得滴度檢測(cè)結(jié)果偏高，而我們實(shí)驗(yàn)是需要有活性的慢病毒才能發(fā)揮轉(zhuǎn)染作用；FACS法所檢測(cè)的熒光蛋白則受到啟動(dòng)子及熒光蛋白在目的細(xì)胞表達(dá)水平的影響，會(huì)使得檢測(cè)結(jié)果偏低。

都能轉(zhuǎn)染細(xì)胞，LV和AdV選哪個(gè)？
慢病毒由于可以插入細(xì)胞基因組，可以實(shí)現(xiàn)目的基因的持續(xù)穩(wěn)定的長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)；而腺病毒不整合到基因組，表達(dá)時(shí)間相對(duì)于慢病毒較短，一般兩三周這樣。

腺病毒的感染效率很高，顯著高于慢病毒，大部分細(xì)胞的感染效率均能達(dá)到95%以上，所以對(duì)于“頑固”細(xì)胞，可以考慮用腺病毒。

慢病毒的包裝周期相對(duì)較短，一般一個(gè)半月左右，但包裝的病毒滴度也相對(duì)較低（一般108 TU/ml）；腺病毒包裝則較為繁瑣，通常需要2個(gè)月或以上，一般可達(dá)到1010 PFU/ml以上，純化后可達(dá)1012 PFU/ml，且純化后的腺病毒可直接用于體內(nèi)注射，但免疫原性較高。我們需根據(jù)兩者特性綜合選擇。

如果我想在你們公司包病毒，需要提供什么？

（1）基因的ID和序列；

（2）所需要病毒的滴度及總量（我們有1×108 TU/ml及以上的各種規(guī)格供選擇），以及是否需要純化；

（3）（非必要）實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皽?zhǔn)備用病毒進(jìn)行的下游實(shí)驗(yàn)，這樣可以更方便我們根據(jù)您的需求制定方案。

多久能拿到LV？拿到后怎么保存？
一般情況，慢病毒包裝整個(gè)過程包括載體構(gòu)建（2~3周），病毒包裝+擴(kuò)增（1~2周），檢測(cè)（約1~2周），順利的話4周左右可以拿到病毒，慢的話不會(huì)超過6周。

收到病毒后若要長(zhǎng)期保存則需放入-80℃冰箱，可保存一年左右；若一周內(nèi)可以用完，則放入4℃冰箱即可。慢病毒應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，理論上每次凍融會(huì)讓病毒活性降低5~10%，因此對(duì)于凍融的病毒，使用前建議重新進(jìn)行滴度檢測(cè)，或考慮分裝使用。

以上就是做病毒包裝實(shí)驗(yàn)中，科研工作者常遇到一些問題及解答，希望對(duì)大家有所幫助。