單細胞懸液制備方法：原代細胞分離操作流程介紹

​​原代細胞 (primary cell) 是指從機體的組織（如人體組織、小鼠組織等）經(jīng)特定方法獲得單個細胞，并在體外進行模擬機體培養(yǎng)的細胞。原代細胞離體時間較短，生物學(xué)特性未發(fā)生較大變化，仍保有機體組織的遺傳特征，能更好地反映細胞在體內(nèi)的生長狀態(tài)，因此可獲得與體內(nèi)生理功能更接近的數(shù)據(jù)，更適合用于藥物測試、細胞分化和轉(zhuǎn)化等實驗研究。

原代細胞分離是指使用酶、螯合劑（常用EDTA）以及機械方法處理動物組織，使其分散為單細胞懸液樣品，后續(xù)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)體系下使分離的原代細胞進行生存、生長和繁殖的過程。針對不同物種的不同組織類型，其具體的操作流程也要進行調(diào)整，常規(guī)原代細胞分離流程為取樣→預(yù)處理→分離處理→過濾清洗→后處理。

01

取樣→預(yù)處理

取樣是原代單細胞懸液制備非常重要的一步，其質(zhì)量會直接影響到后續(xù)處理效果。

操作時，首先根據(jù)不同實驗需求麻醉或處死動物后進行消毒、固定并切開相應(yīng)位置皮膚暴露目的組織。
 

（▲暴露目的組織）

同時不同組織類型，取樣時也有細微差別。
 

其次操作過程中有以下幾點也需要注意：

• 嚴格無菌操作，快速處理；
• 針對不同組織類型控制環(huán)境溫度；
• 保證工具鋒利，減少機械損傷，動作輕柔，保持組織濕潤；
• 盡量去除非相關(guān)組織，尤其是殘留的小血管等；
• 完整記錄組織情況、重量等信息。

拿到樣本后針對不同分離流程選擇不同的預(yù)處理方式（如將腫瘤組織剪切到2-4mm左右的小塊），如血液細胞等已經(jīng)是單細胞懸液的樣本在簡單的離心換液過后就可以直接使用了，其他類型的組織還需要進一步解離。
 

（▲組織預(yù)處理）

02

分離處理

常規(guī)組織處理一般有兩種方法，分別是通過物理機械剪切和化學(xué)生物酶解來實現(xiàn)細胞分離。

物理機械剪切是使用勻漿機打散組織或者使用剪刀、銅網(wǎng)或者組織研磨器進行的剪碎法、網(wǎng)搓法和研磨法。這種方法成本低，操作簡單、快速，但對組織機械損傷巨大，而且細胞分散效果不盡人意，只適用于一些質(zhì)地軟且較為松散的軟組織。

化學(xué)生物酶解法是組織樣本預(yù)處理之后，在酶的作用下，破壞組織間的膠原纖維和彈性纖維，同時水解粘多糖及其他連接細胞間的蛋白質(zhì)；或者通過EDTA等化學(xué)物質(zhì)與細胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機械力使細胞變圓而分散細胞，尤其對上皮組織的分散效果很好。

使用酶解體系進行組織解離時還需注意酶的選擇和配比，最常使用胰蛋白酶和膠原酶進行處理。其中胰蛋白酶對蛋白質(zhì)有水解作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)消化溶解而使細胞分散開，適用于多種組織。

膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用。適用于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細胞間質(zhì)有較好的消化作用。不同的膠原酶適用的組織也會有不同。
 

除上述兩種最常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶這種解離效果強但容易造成細胞損傷以及解離效果弱，但對細胞損傷較小的裂解酶，可以根據(jù)實際樣本的情況進調(diào)整，或者通過復(fù)配聯(lián)用達到更好的效果，例如可以使用透明質(zhì)酸酶與膠原酶聯(lián)用消化細胞間基質(zhì)等。

同時，在進行消化處理的時候佐以機械剪切，便能使組織分散得更加均勻，樣本處理效果更好。另外實驗操作中還需要注意以下幾點：

• 預(yù)處理好的組織塊需要在緩沖液中清洗，避免影響后續(xù)實驗；
• 酶量和作用時間應(yīng)根據(jù)組織量及時調(diào)整，避免消化時間過長影響細胞狀態(tài)，期間需要搖晃整個解離體系以保證組織塊接觸均勻；
• 嚴格控制溫度濕度條件，雖然胰蛋白酶發(fā)揮效果的最佳溫度是56℃，但是細胞無法承受如此高溫，所以需要在37℃環(huán)境進行處理，另外還有部分組織需要冷消化處理；
• 酶的保存也需要注意，凍干粉要注意防潮，溶解后避免反復(fù)凍融，如蛋白水解酶可以自動分解，因此建議在使用前立即將其溶解，并在冰上保存2°C～8°C。

原代細胞分離過程復(fù)雜，同時整個分離處理過程都需要人工參與，機械剪切過程難以控制實驗可重復(fù)性。隨著科技的進步，瑞沃德單細胞懸液制備儀輕松化解這一難題，自主研發(fā)的組織處理管、酶解試劑盒和內(nèi)置不同組織優(yōu)化處理程序，可將組織制備成高活性單細胞懸液或組織勻漿。
 

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根據(jù)實際樣本可在15-30min內(nèi)完成活性高、均一性好的單細胞懸液制備，大大增加實驗可重復(fù)性。擁有獨立運行的四通道，搭配加熱套實現(xiàn)全自動處理，提高組織處理效率。廣泛應(yīng)用在單細胞測序、原代細胞培養(yǎng)、流式分析、細胞分選、細胞治療等研究領(lǐng)域。
 

03

過濾清洗→后處理

在分離處理操作結(jié)束后要對樣品進行過濾、離心、換液，對獲得的單細胞懸液進行細胞計數(shù)和活力分析，終止反應(yīng)并將細胞置于培養(yǎng)體系或相應(yīng)的緩沖體系中。

（▲活細胞計數(shù)）

自動細胞計數(shù)儀的使用可以對原代細胞進行精準(zhǔn)計數(shù)，瑞沃德C100自動細胞計數(shù)儀可配合多熒光通道，對懸液中的細胞進行定量分析，并同時顯示明場及熒光圖像，清晰呈現(xiàn)計數(shù)結(jié)果及細胞形態(tài)。適用于免疫學(xué)及疫苗開發(fā)、細胞治療、腫瘤研究、干細胞及代謝研究等研究領(lǐng)域的細胞分析。
 

細胞培養(yǎng)是原代細胞分離流程最后一步，瑞沃德二氧化碳培養(yǎng)箱，可精準(zhǔn)控制溫度、二氧化碳濃度，并且是維持高濕度環(huán)境的高性能細胞培養(yǎng)箱。HEPA高效過濾器可有效去除空氣中的微粒污染，140℃高溫干熱滅菌功能可實現(xiàn)培養(yǎng)箱的定期滅菌維護，為原代細胞樣品提供穩(wěn)定潔凈的培養(yǎng)環(huán)境。