益氣解毒化瘀湯（YJHD）通過促進(jìn)自噬減輕糖尿病腎病小鼠腎損害

文章標(biāo)題：Yiqi Jiedu Huayu Decoction Alleviates Renal Injury in Rats With Diabetic Nephropathy by Promoting Autophagy
發(fā)表期刊：Frontiers in Pharmacology
發(fā)表時間：2021年4月
影響因子：5.81
合作客戶：重慶醫(yī)科大學(xué)
百趣生物提供服務(wù)：中藥非靶標(biāo)代謝組學(xué)

01 研究背景
糖尿病是一種慢性代謝疾病，是世界上最重要的健康問題之一。患者數(shù)量多，據(jù)統(tǒng)計全球糖尿病患者數(shù)量將在2035年達(dá)到5.92億。糖尿病腎病(DN)是糖尿病引起的常見微血管并發(fā)癥，是終末期腎功能衰竭(ESRD)的主要原因。糖尿病腎病組織損傷包括系膜擴(kuò)張、基底膜增厚和腎纖維化。腎纖維化的發(fā)展是糖尿病腎病患者腎功能持續(xù)下降并最終發(fā)展為終末期腎病的重要原因。足細(xì)胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，足細(xì)胞損傷時引發(fā)糖尿病腎病持續(xù)性蛋白尿和腎纖維化的重要原因。足細(xì)胞作為終末分化細(xì)胞，受損難再生。因此，足細(xì)胞具有很高基礎(chǔ)自噬水平在面對各種刺激時保持自身的動態(tài)平衡。在糖尿病腎病患者體內(nèi)足細(xì)胞的自噬活性受到抑制，自噬主要受mTOR通路調(diào)控，抑制mTOR通路可以促進(jìn)自噬，改善足細(xì)胞損傷和腎功能。因此，靶向mTOR通路可能是治療DN的一種合適的治療方法，促進(jìn)自噬活性，改善足細(xì)胞損傷和腎臟病理損傷，恢復(fù)腎功能。

糖尿病腎病的治療措施主要包括控制血糖、血脂、血壓和應(yīng)用血管活性藥物。厄貝沙坦作為血管緊張素II受體阻滯劑是臨床治療糖尿病腎病的代表性藥物，能有效降低患者的蛋白尿。在一定程度上延緩了DN的發(fā)展，但不針對腎臟損傷，難以完全預(yù)防腎功能衰竭。因此，有必要開發(fā)安全有效的治療方法。益氣解毒化瘀湯(YJHD)是一種經(jīng)改良的中藥方劑，已用于臨床治療糖尿病腎病(DN)。YJHD由七種草藥組成，其中黃芪、葛根、黃連和桑葉已被證明對糖尿病及糖尿病并發(fā)癥有治療作用。重慶醫(yī)科大學(xué)曹文富課題組軒晨在相關(guān)研究工作中，使用YJHD，旨在調(diào)節(jié)PI3K/Akt、AMPK和mTOR通路的活性，促進(jìn)自噬，減輕足細(xì)胞損傷和腎臟病變，改善腎功能。

02 研究設(shè)計
將Sprague-Dawley小鼠隨機(jī)分為空白對照、陰性對照、糖尿病模型、厄貝沙坦處理(陽性藥物組)和低、中、高（YJHD-L、M、H）3個劑量處理組。用鏈脲佐菌素復(fù)制動物模型，然后YJHD治療，連續(xù)12周。實驗期間采集血液和尿液樣本，并對代謝和腎功能進(jìn)行了評估。通過腎臟形態(tài)、蘇木.精-伊紅染色、馬森染色、高.碘.酸席夫染色、高.碘.酸席夫甲.胺染色和透射電鏡觀察，評價腎臟病理損傷程度。采用免疫組織化學(xué)、蛋白印跡分析和實時熒光定量PCR(Real-time qPCR)分別檢測蛋白和基因的表達(dá)水平。

03 研究結(jié)果
1.YJHD成分鑒定（百趣中藥非靶）
客戶送中藥口服試劑到我司檢測，采用UHPLC-MS/MS對YJHD樣品進(jìn)行了測定分析，揭示了所有化合物的化學(xué)組成。共鑒定出15個活性成分(圖1C)：1)萼花苷-7-葡萄糖苷，2)山.奈酚，3)黃芩素，4)木犀草素，5)萼花素，6)黃芪甲苷IV，7)槲皮素，8)異鼠李素，9)橙皮素，10)蘆丁，11)巴馬汀氯，12)芒柄花素，13)隱丹參酮，14)小檗堿，15)葛根素。
 

圖1. YJHD化學(xué)成分鑒定

2.糖尿病癥狀改善和腎功能保護(hù)
測定陰性對照組和空白對照組小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平，以評價YJHD的安全性。證實YJHD無肝毒性作用(圖2J)。藥物干預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)對照組體重增加，而糖尿病組生長停滯。與糖尿病組比較，YJHD-H組小鼠體重明顯增加。與空白對照組相比，其他處理組小鼠24小時攝食量和飲水量均顯著增加。YJHD-H組的對于糖尿病癥狀的改善最為明顯（評估指標(biāo):24h尿量、24h尿蛋白定量、血清Cr等），證實YJHD能改善糖尿病小鼠的癥狀和腎功能，其中以高劑量組的效用最為明顯。
 

圖2. YJHD改善糖尿病癥狀和腎功能

3.YJHD減輕腎組織病理損傷
作者通過對比7組小鼠腎臟外觀，HE、PAS、PASM染色和透射電子顯微鏡下腎臟組織結(jié)構(gòu)形態(tài)圖，糖尿病組小鼠腎臟增大，組織形態(tài)異常，系膜區(qū)擴(kuò)張，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚，基底膜增厚，足細(xì)胞形態(tài)異常，足突融合缺失。陽性藥物組和YJHD-H組能夠明顯減輕糖尿病小鼠腎臟損傷。
 

圖3. YJHD減輕腎組織學(xué)損傷

4.YJHD改善腎纖維化
作者通過腎組織染色、qPCR、Western blot和免疫組織化學(xué)方法檢測了ECM的主要成分IV型膠原和纖維連接蛋白的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)與糖尿病小鼠相比，YJHD-H組腎臟膠原纖維數(shù)量明顯減少，腎纖維化程度明顯改善，并且顯著降低腎臟IV型膠原和纖維連接蛋白表達(dá)。證實了YJHD-H有效減緩糖尿病腎病小鼠腎臟纖維化。
 

圖4.YJHD改善腎纖維化

5.YJHD減輕足細(xì)胞損傷
作者通過透射電鏡觀察小鼠細(xì)胞形態(tài)，糖尿病腎病小鼠足細(xì)胞形態(tài)受損，足突融合，而對照組則顯示正常的細(xì)胞形態(tài)。此外，測定各組足細(xì)胞的podocin和neparin表達(dá)，其在糖尿病組表達(dá)顯著降低，證實了糖尿病組小鼠足細(xì)胞減少。陽性藥物組和YJHD-H 均能促進(jìn)其表達(dá)，從而減輕足細(xì)胞損傷。表明YJHD-H小組能夠減輕糖尿病腎病小鼠足細(xì)胞損傷。
 

圖5. YJHD可減輕足細(xì)胞損傷

6.YJHD促進(jìn)自噬
作者通過評估對細(xì)胞自噬起重要作用的Beclin-1、p62和LC3II基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平來評估自噬程度。發(fā)現(xiàn)糖尿病組小鼠自噬受到抑制，YJHD-H 組通過上調(diào)Beclin-1和LC3II的表達(dá)，下調(diào)p62的表達(dá)促進(jìn)自噬，推測這可能是其減輕足細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。
 

圖6.YJHD對自噬的影響

7.YJHD對mTOR通路的影響
mTOR途徑是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵途徑，激活的mTOR磷酸化ULK1抑制足細(xì)胞自噬。作者測定了mTOR、p-mTOR及其下游的ULK1和p-ULK1在腎臟中的表達(dá)水平。糖尿病小鼠mTOR、p-mTOR和p-ULK1表達(dá)顯著增加。與其相比，YJHD-H組mTOR、p-mTOR和p-ULK1表達(dá)顯著降低，結(jié)果揭示了YJHD-H組可抑制mTOR通路的激活。
 

圖7.YJHD對mTOR通路的影響

8.YJHD對PI3K/Akt和AMPK通路的影響
mTOR途徑主要受PI3K/Akt和AMPK途徑調(diào)控。作者測定了腎臟中PI3K/Akt和AMPK途徑蛋白的表達(dá)。與糖尿病組比，YJHD-H組小鼠通過降低IRS1和p-Akt表達(dá)，抑制PI3K/Akt通路，這與抑制mTOR通路的作用一致。AMPK通路對自噬有正向調(diào)節(jié)作用，這與抑制mTOR通路激活有關(guān)。與糖尿病組比較，YJHD-H組小鼠通過LKB1和p-AMPK的表達(dá)，激活A(yù)MPK途徑。
 

圖8. 對PI3K/Akt和AMPK通路的影響


 

圖9. 自噬過程示意圖