細(xì)胞把脈-細(xì)胞的狀態(tài)分析與解決操作方法

細(xì)胞養(yǎng)著養(yǎng)著就變樣了，狀態(tài)不好“生病了”，怎么辦？
教您細(xì)胞界的“望、聞、問(wèn)、切”，給您的細(xì)胞“把把脈~”
 

細(xì)胞狀態(tài)不好，總結(jié)下來(lái)可以從以下幾點(diǎn)出發(fā)考慮：

導(dǎo)致細(xì)胞污染的原因主要有以下幾方面：
1. 環(huán)境：水浴鍋、培養(yǎng)箱水盤、細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)壁、超凈臺(tái)、桌面及試劑瓶身、細(xì)胞房空氣消毒。
2. 操作：細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、凍存等過(guò)程中也可帶入污染。
3. 試劑：血清、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰酶、輔助試劑、營(yíng)養(yǎng)添加物等。
4. 耗材：培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶、槍頭。
5. 細(xì)胞本身：本身攜帶污染、細(xì)胞老化、分化等。
接下來(lái)我們按照此步驟一步步進(jìn)行分析：

環(huán)境
環(huán)境需要考慮到的因素有：

水浴鍋、培養(yǎng)箱水盤

由于長(zhǎng)期處于潮濕狀態(tài)，水是一個(gè)很重要的污染源，建議兩周更換一次高壓滅菌水。并且添加水浴鍋專用消毒預(yù)防試劑（Aquaguard-2，貨號(hào): 01-916-1E）和培養(yǎng)箱水盤（Aquaguard-1，貨號(hào): 01-867-1B）專用消毒預(yù)防試劑。

Aquaguard-1
用來(lái)消毒培養(yǎng)箱中的水盤，可有效殺滅細(xì)菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒；無(wú)毒；對(duì)不銹鋼無(wú)腐蝕性；不揮發(fā)。

用法：
1. 培養(yǎng)箱建議每?jī)芍苓M(jìn)行一次系統(tǒng)地清潔和消毒。
2. 稀釋100倍即可使用，即將1L水中加入10ml的Aquaguard-1溶液。

Aquaguard-2
用來(lái)消毒水浴鍋，可有效殺滅細(xì)菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒。
用法：
1. 建議每周進(jìn)行一次系統(tǒng)地清潔和消毒水浴鍋。
2. 稀釋500倍即可使用，即將1L水中加入2ml的Aquaguard-2溶液。

• 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)壁
  每星期需要清潔一次，保持潔凈狀態(tài)。每年對(duì)CO₂、溫度探頭校準(zhǔn)一次。

• 超凈臺(tái)、桌面及試劑瓶身
  要經(jīng)常擦拭，以防帶入外源污染。

• 細(xì)胞房空氣消毒
  可選擇紫外殺菌、高錳酸鉀-甲醛熏蒸、過(guò)氧化氫-過(guò)氧乙酸干霧滅菌、臭氧滅菌等方法徹底清潔細(xì)胞房空氣，每種方式各有優(yōu)缺點(diǎn)、可綜合考慮及比較后擇優(yōu)使用。

培養(yǎng)箱內(nèi)壁、超凈臺(tái)、桌面及試劑瓶身都可考慮使用：
 

Pharmacidal™ Sprays and Solution 消毒噴壺溶液
 

主要成分：Pharmacidal 是由篩選過(guò)的有機(jī)氮化合物組成，主要組成成分為：芐基二甲基辛基氯化銨、芐索氯銨、氯化芐乙基銨、三羥乙基胺，并添加丙二醇等清潔消毒劑。

作用原理：Pharmacidal作用方式是使脂質(zhì)變性，分解細(xì)胞膜的雙層磷脂質(zhì)和增加細(xì)胞通透性，導(dǎo)致酶的滅活，蛋白質(zhì)沉淀，與DNA和RNA產(chǎn)生反應(yīng)。

特點(diǎn)：
1. Pharmacidal 對(duì)大部分的細(xì)菌、芽孢、支原體、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒都有效。
2. 不含汞、甲醛、苯酚和酒精，可生物降解、無(wú)毒、無(wú)刺激，對(duì)一般的工作臺(tái)面和器材沒(méi)有腐蝕性和任何損傷。

使用方法：
1. 可消毒橡膠手套、超凈臺(tái)面、桌面、顯微鏡臺(tái)、試劑瓶身等物體表面，噴涂完全濕潤(rùn)，不需擦拭，自然風(fēng)干。
2. 培養(yǎng)箱內(nèi)壁噴涂完全濕潤(rùn)后，等待10分鐘，用無(wú)菌吸水紙吸干內(nèi)壁上的殘留液體。

操作
操作過(guò)程中人是最大的一個(gè)污染源，人類1個(gè)小時(shí)會(huì)脫落3*10⁴-4*10⁴個(gè)細(xì)胞；24小時(shí)會(huì)脫落10⁸個(gè)細(xì)胞，1年會(huì)脫落3.6kg的死細(xì)胞。從人身上掉落的顆粒達(dá)到10⁴/min（顆粒直徑0.5μm）。

人	腳	100-1000 個(gè)微生物/cm2
	頭皮	106個(gè)微生物/cm2
	額頭	105個(gè)微生物/cm2
	噴嚏	104 – 105個(gè)微生物
	唾液	107個(gè)微生物/mL
無(wú)菌服	6小時(shí)后	1 – 6個(gè)微生物/cm2
空氣	戶外	100 – 500個(gè)微生物/m3
	戶內(nèi)	500 – 2000個(gè)微生物/m3

人類的皮膚總面積約2m²，生活約10¹²個(gè)微生物；我們1g的排遺物中約有10¹²個(gè)微生物。    

如何進(jìn)行污染源排查？
可通過(guò)控制變量法對(duì)整個(gè)培養(yǎng)操作流程進(jìn)行分析：培養(yǎng)試劑及輔助試劑等條件不變，重新復(fù)蘇一株細(xì)胞，復(fù)蘇時(shí)水浴要注意水浴不能沒(méi)過(guò)凍存管瓶蓋，傳代時(shí)不能觸碰吸管尖頭部或容器瓶口。操作前需要用75%的酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面。觀察細(xì)胞是否有污染現(xiàn)象。
 

試劑
☆  空培不能用于污染來(lái)源排查

• 分別空培胰酶、PBS、凍存液、高壓水。即便存在污染，但是由于營(yíng)養(yǎng)（碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子）不完全，不一定會(huì)像實(shí)驗(yàn)中那樣長(zhǎng)出菌斑。

• 空培血清時(shí)，因?yàn)檠�清中富含蛋白，空培過(guò)程中會(huì)有沉淀產(chǎn)生，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，沉淀會(huì)逐漸增多，而這些沉淀往往會(huì)被誤以為是污染。

• 空培完全培養(yǎng)液（血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)基）時(shí)，首先要會(huì)區(qū)分沉淀和污染。因此對(duì)經(jīng)驗(yàn)要求高。其次，若完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后有污染出現(xiàn)，也不好判斷是血清還是基礎(chǔ)培養(yǎng)基，或者是操作過(guò)程中帶入的污染。

如何進(jìn)行污染源排查？

血清：其他試劑保持不變，僅更換血清。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基：其他試劑保持不變，僅更換基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
PBS：其他試劑保持不變，僅更換PBS。
胰酶：若細(xì)胞復(fù)蘇的很好，一傳代就污染，可以嘗試其他試劑保持不變，更換消化用胰酶，看細(xì)胞狀態(tài)。

細(xì)胞反復(fù)復(fù)蘇都會(huì)出現(xiàn)污染，那可保持培養(yǎng)體系不變，培養(yǎng)其他類型且適用于此培養(yǎng)體系的細(xì)胞，觀察是否有污染出現(xiàn)。整個(gè)營(yíng)養(yǎng)體系：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、營(yíng)養(yǎng)添加物都可使用控制變量法進(jìn)行排查。

耗材
培養(yǎng)基及輔助試劑等條件不變，使用新耗材（培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶、槍頭）培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞是否有污染。

細(xì)胞本身

• 細(xì)胞本身攜帶污染源�？蓪�(duì)細(xì)胞進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)（細(xì)菌、真菌、支原體）。

• 細(xì)胞分化，細(xì)胞一旦分化，很難逆轉(zhuǎn)，無(wú)法通過(guò)外界營(yíng)養(yǎng)體系和生長(zhǎng)條件的調(diào)整“起死回生”。

• 細(xì)胞老化：細(xì)胞一旦老化，是無(wú)法逆轉(zhuǎn)的。

因此，大家需要學(xué)會(huì)觀察細(xì)胞的形態(tài)并進(jìn)行分析，可以按照這幾點(diǎn)進(jìn)行控制變量排查，如若確認(rèn)是細(xì)胞本身問(wèn)題，若細(xì)胞本身不是很昂貴，建議丟掉重新培養(yǎng)，若較珍貴，污染后可嘗試根據(jù)污染種類選擇合適的抗生素進(jìn)行殺滅，分化和老化是沒(méi)有辦法補(bǔ)救的。
 

好啦，今天的講解就到這里啦，
細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題的老師也不要著急哦，
按照上述辦法可以自行排查下污染源，
根據(jù)結(jié)果選擇相應(yīng)對(duì)策解決問(wèn)題~
祝各位老師實(shí)驗(yàn)順利哦

 

歡迎關(guān)注公眾號(hào)留言咨詢，給您最合適的解決方案~

了解詳細(xì)信息可戳原文，轉(zhuǎn)載請(qǐng)標(biāo)明出處。
BI 中國(guó)市場(chǎng)部：上海逍鵬生物科技有限公司