利用質(zhì)譜技術進行臨床癌癥蛋白質(zhì)組學研究
臨床樣品的制備方法
對于臨床組織研究，為了保證從手術切除到蛋白質(zhì)酶解過程中的蛋白質(zhì)量，正確的保存方式非常關鍵。有幾種方法可以選擇：新鮮冷凍（FF）、福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）和OCT包埋。FF與FFPE相比可檢測到更多的蛋白質(zhì)，但現(xiàn)有的FFPE已經(jīng)儲存了幾年甚至十幾年，是臨床隨訪等回顧性研究的重要樣品來源。雖然組織的蛋白質(zhì)組學研究可探究生物機制信息，但臨床蛋白質(zhì)組學研究以發(fā)現(xiàn)新的生物標志物為主要目標，因此“體液”樣品如血液（血清、血漿）、尿液、唾液、淚液和腦脊液等是較為理想的樣品形式，還可用于檢測癌癥和治療反應發(fā)展的縱向研究中。當臨床樣品質(zhì)量不足以支持研究時，可考慮使用模型系統(tǒng)如轉(zhuǎn)基因動物模型、癌細胞系、異種移植模型（CDX、PDX）、類器官等。
蛋白質(zhì)組樣品制備沒有統(tǒng)一的方案，要根據(jù)樣品復雜性、樣品量和研究目的選擇合適的方法并優(yōu)化。制備的主要方法有FASP、MStern、S-trap、SP3和iST等。這里以FASP為例進行介紹。FASP，即過濾器輔助的樣品制備法，首先使用陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解蛋白質(zhì)，然后使用分子量（MW）過濾將蛋白質(zhì)結合到硝酸纖維素過濾器上，而較低MW的物質(zhì)則被過濾掉，連續(xù)的尿素洗滌有助于更好地去除SDS，最后是過濾器上的蛋白酶解和洗脫獲得多肽產(chǎn)物。
MS檢測原理及流程
為了在檢測時增加蛋白質(zhì)組的覆蓋率，肽段樣品首先通過反相液相色譜等方法分成不同餾分后進入MS分析。利用軟電離技術（ESI或MALDI）對肽段進行離子化，霧化的多肽可以通過離子遷移率進一步分離，從而降低一級質(zhì)譜（MS1）的復雜性和二級質(zhì)譜（MS2）的污染，并最終實現(xiàn)更大的蛋白質(zhì)組覆蓋率。這樣的技術包括離子淌度（TIMS）和高強場離子遷移譜和（FAIMS）。在質(zhì)譜掃描模式的選擇上，傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)依賴采集（DDA）模式在蛋白質(zhì)組學研究非常成熟，且兼容基于標簽的定量技術。在DDA中，MS1掃描結果中信號最強的前n個母離子才會被選擇并進行順序碎裂和MS2檢測。但是，這種模式的檢測重復性差，且存在MS1中高豐度肽影響低豐度肽檢出的問題。由于DDA的缺點，蛋白質(zhì)組學研究開始傾向于使用數(shù)據(jù)非依賴采集（DIA）模式。在該模式下，在多個小范圍的質(zhì)荷比窗口中的所有母離子順序碎裂產(chǎn)生更復雜的MS2結果。然后將這些結果與預先定義好的譜圖庫進行匹配，通過大范圍的肽分級達到最大的蛋白質(zhì)組深度。
臨床腫瘤蛋白質(zhì)組學策略
蛋白定量檢測方法
蛋白定量檢測技術多種多樣，按照檢測范圍可分為靶向與非靶向技術，也可按照定量方式分為相對定量或絕對定量技術。其中，相對定量技術又可分為標記技術（TMT和iTRAQ）和非標記技術（label-free、DIA）。標記相對定量技術中TMT標簽可增加樣品通量到16個。然而， TMT方法需要多級的肽分級來獲得深入的蛋白質(zhì)組圖譜，并且1-2個TMT通道常用于檢測所有樣品的混樣來減少批間差，這降低了各個項目之間進行有效比較的能力，并增加檢測成本。而label-free技術，得益于數(shù)據(jù)分析軟件的發(fā)展，可以從MS1的肽離子峰分數(shù)計算出蛋白質(zhì)的相對豐度。與標記技術相比，非標記技術具有更寬廣的動態(tài)范圍，但精準度會稍差一些。因此，對于患者間和患者內(nèi)存在較大蛋白質(zhì)表達差異的臨床樣品，label-free定量技術更適合鑒定出更多的差異表達蛋白。
通過非靶向相對定量檢測技術篩選到的目標蛋白質(zhì)需要進行表達驗證，如基于抗體的ELISA和基于MS的靶向分析技術。其中，基于MS的靶向定量技術有多反應檢測（MRM）和平行反應檢測（PRM）兩種。MRM使用三重四極桿質(zhì)譜儀進行分析，需要先確定目標母離子和碎片離子的質(zhì)荷比，由四極桿選擇母離子和3-5個相關碎片離子的組合并進行定量分析。而PRM利用高分辨率質(zhì)譜提高特異性。PRM中所有碎片離子都是在分析中生成并被記錄，所以只需要確定目標母離子的質(zhì)荷比并直接從二級質(zhì)譜中選擇最好的碎片離子即可進行定量分析。如果加入用穩(wěn)定同位素標記的肽標準品做對照，這兩種靶向技術可達到絕對定量水平。兩種技術相比，PRM能可靠地監(jiān)測更多的靶點。
臨床蛋白質(zhì)組學的應用方向
在腫瘤學研究中，組織分析能夠最準確地反映腫瘤的生理狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)生物標志物、生物學通路，并與現(xiàn)有的基因組學和轉(zhuǎn)錄組學結果整合做多組學分析。這類研究通常使用同一患者的癌組織樣品和癌旁“健康”對照樣品比較尋找潛在的診斷biomarker。同時，對不同癌癥分期患者比較獲得預后信息。當鑒定到較少數(shù)量的候選蛋白后，就可以利用通路分析深入了解這些蛋白是如何與腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和其他癌癥驅(qū)動過程相關的，隨后在獨立大隊列樣品中補充差異表達蛋白的驗證實驗�？偨Y目前科研現(xiàn)狀，癌癥蛋白質(zhì)組學的研究方向主要有尋找風險預測、癌癥分級和預后的標志物、確認有效的治療靶點和翻譯后修飾如磷酸化、乙�；�、糖基化等。此外，腫瘤異質(zhì)性問題對單細胞水平的蛋白質(zhì)研究提出了要求�；谫|(zhì)譜的質(zhì)譜流式技術可以在單個細胞中監(jiān)測幾十個蛋白質(zhì)標志物，將抗體探針和獨特的重金屬同位素連接在一起后與細胞孵育，然后細胞被感應耦合等離子體(ICP)霧化，金屬離子向質(zhì)譜儀提供目標蛋白在樣本中的定量讀數(shù)。
2019年10月在《Cell》上發(fā)表的“Integrated Proteogenomic Characterization of HBV-Related Hepatocellular Carcinoma”一文中，作者利用多組學研究思路，對159位感染乙型肝炎病毒的肝細胞癌患者的配對癌組織和癌旁肝組織進行了基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組研究，發(fā)現(xiàn)了代謝改變對肝癌晚期發(fā)展和不良預后的影響，并對肝細胞癌進行了蛋白層面的精準分型，為個性化靶向治療提供了新策略。
臨床蛋白質(zhì)組學的研究前景
隨著標準化、高通量的蛋白質(zhì)組學技術不斷發(fā)展，臨床研究將向著更大隊列的方向進步，這將使蛋白質(zhì)組學研究結果更具有統(tǒng)計學意義，并提高蛋白標志物和藥物靶點臨床轉(zhuǎn)化的效率。另一方面，蛋白質(zhì)組學將通過集成基因組學、表觀基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和翻譯后修飾組學等多組學數(shù)據(jù)，成為癌癥系統(tǒng)生物學的重要組成部分。
參考文獻
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Zhang, Yaoyang et al. “Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics.” Chemical reviews vol. 113,4 (2013): 2343-94.
Gao, Qiang et al. “Integrated Proteogenomic Characterization of HBV-Related Hepatocellular Carcinoma.” Cell vol. 179,2 (2019): 561-577.e22.
