人血清中Fn14超高靈敏度單分子檢測(cè)方法的建立

Simoa單分子免疫陣列分析技術(shù)是目前市面上最靈敏的蛋白分子檢測(cè)技術(shù)，其可以檢測(cè)單個(gè)蛋白分子，靈敏度達(dá)到飛克級(jí)別。在腫瘤、神經(jīng)、感染免疫、心血管、炎癥、生殖、眼科等領(lǐng)域都有著廣泛應(yīng)用。Simoa平臺(tái)是一個(gè)開(kāi)放的研究平臺(tái)，除現(xiàn)有的商品化試劑盒之外，各領(lǐng)域的研究人員都可自行進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)及分析。

今天給大家分享的這篇文章發(fā)表于ANAL BIOCHEM上，本文詳細(xì)介紹了homebrew 的開(kāi)發(fā)過(guò)程，包括原理介紹、抗體選擇、磁珠包被、特異性分析、回收率的計(jì)算等，是一篇關(guān)于Homebrew開(kāi)發(fā)的經(jīng)典文獻(xiàn)。

摘   要   
受體蛋白Fn14是腫瘤壞死因子（TNF）超家族中的最小成員，在一些疾病中，如癌癥、自身免疫性疾病、腎臟疾病等中會(huì)過(guò)度表達(dá)，因此常被作為蛋白生物標(biāo)記物用來(lái)監(jiān)測(cè)和指示生理和病理進(jìn)展。來(lái)自湖南大學(xué)的研究者們基于Simoa平臺(tái)，開(kāi)發(fā)了一種用于檢測(cè)Fn14的超靈敏分析法。他們共篩選了44對(duì)不同的抗體對(duì)，試劑盒的檢測(cè)范圍為1.26 pg/mL~3683 pg/mL，檢測(cè)下限為0.32 pg/mL，遠(yuǎn)低于市售的傳統(tǒng)ELISA試劑盒，且分析全程自動(dòng)化，只需大約一個(gè)小時(shí)即可完成。

圖1. 基于Simoa的Fn14檢測(cè)原理

首先，將Fn14捕獲抗體包被在磁珠上，并與靶蛋白形成夾心免疫復(fù)合物，然后用SβG標(biāo)記珠子。最后，將珠子推入到光盤(pán)的微孔中并與RGP熒光底物反應(yīng)。由于微孔非常小，能檢測(cè)到單個(gè)酶分子的存在，所以反應(yīng)的靈敏度非常高。通過(guò)計(jì)算微孔中每個(gè)磁珠結(jié)合的平均酶數(shù)（AEB）來(lái)檢測(cè)Fn14蛋白質(zhì)的濃度。

實(shí)驗(yàn)方法   

圖2. Fn14抗體對(duì)的檢測(cè)可行性研究
 

本文對(duì)10種抗體（5種單克隆抗體和5種多克隆抗體）進(jìn)行了配對(duì)篩選。通過(guò)ELISA從44個(gè)抗體對(duì)組合中篩選出2對(duì)結(jié)果最好的組合，在Simoa平臺(tái)上進(jìn)行驗(yàn)證，如圖所示，m5+m2抗體對(duì)結(jié)果令人滿(mǎn)意。

所用抗體對(duì)和標(biāo)準(zhǔn)品信息

圖3. 兩步法和三步法的優(yōu)化比對(duì)

圖4. Fn14試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)曲線

表1. Simoa試劑盒與傳統(tǒng)ELISA試劑盒的性能比較

圖5. 試劑盒的特異性檢測(cè)
在樣本中加入CRP、IL-6、IL-8、p53、FGF2和FGF21等物質(zhì)作為干擾蛋白（每種濃度為10ng/mL，F(xiàn)n14為100pg/mL）來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，如圖所示，試劑盒對(duì)Fn14的特異性非常高。

圖6. 人血清樣品中Fn14的稀釋線性

將健康人血清按照1:2、1:4、1:6和1:8進(jìn)行稀釋?zhuān)▁軸上分別表示為0.5、0.25、0.167和0.125）后進(jìn)行測(cè)試，如圖顯示出良好的線性關(guān)系。

表2. 三種加標(biāo)濃度下Fn14的回收率

結(jié)  論   
本研究開(kāi)發(fā)了一種超靈敏的Simoa Fn14檢測(cè)方法，該方法在血清樣本中具有良好的特異性和適用性。其LOD為0.32pg/mL，大大低于常規(guī)免疫檢測(cè)方法；動(dòng)態(tài)范圍寬，即使在極低濃度下也可用于準(zhǔn)確檢測(cè)血清Fn14。 

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