SCIENION高精度噴點設(shè)備在生成高多樣性液滴文庫中的應用

微流控技術(shù)的應用，包括組合化學合成、DNA編碼文庫和大規(guī)模多重PCR，需要由許多封裝在單獨液滴中的試劑組成的液滴文庫。然而，現(xiàn)有的生成它們的方法既費力又不切實際。這里描述了一種使用標準化噴點設(shè)備的自動化方法。該方法可以在微流控設(shè)備手動操作的一小部分時間內(nèi)控制乳化數(shù)百種不同的試劑，且無需任何用戶干預。我們證明，由spotter產(chǎn)生的液滴與微流體產(chǎn)生的液滴具有相似的均勻性，并在約4h內(nèi)自動生成含有192種不同試劑的約2mL乳液。它可以很容易地生成高度多樣性的液滴庫，這將使組合應用在液滴微流控中更加可行。此外，該儀器作為一個自動液滴發(fā)生器，允許在沒有微流控專業(yè)知識的情況下執(zhí)行液滴反應。

液滴微流體使用微米級油包水乳液，以高通量和最少的試劑進行分析。這些特性使得傳統(tǒng)的基于移液管的液體處理難以或不可能應用。液滴微流控技術(shù)最成功的應用是高通量生物測定法，它可以分析大量的離散成分，如DNA分子、功能化b eads或細胞。例如，在酶篩選中，樣本可以由表達文庫變體的微生物組成，而在單細胞基因組學中，樣本可以由具有獨特分子特征的細胞組成。在此類應用中，含有不同離散成分但試劑條件一致的液滴允許高通量定量分析。例如，統(tǒng)一的催化測量可以根據(jù)活性對酶變體進行評分，而統(tǒng)一的反應條件可以對數(shù)千個不同的單細胞t轉(zhuǎn)錄體進行編碼和排序。然而，其他應用要求液滴內(nèi)的試劑也發(fā)生變化。例如，組合化學通過在不同組合中混合一組固定的輸入反應物來合成化學庫。類似地，藥物篩選針對模型系統(tǒng)單獨或組合測試數(shù)百種化合物，以獲得所需的反應。這種組合應用將大大受益于液滴微流體的速度和效率，但由于快速生成不同試劑液滴庫的困難而受到限制。

生成液滴庫的常用策略是按順序乳化每種溶液并匯集產(chǎn)品。然而，當手動執(zhí)行時，該方法僅適用于少量試劑。自動乳化更具可擴展性，但需要與微流控設(shè)備接口的定制機器，而微流控設(shè)備在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性。這兩種方法都受到一個速度的限制，污染是一個主要問題，因為所有溶液都由同一個設(shè)備乳化。并行裝置通過在其自身的滴液器中乳化每種溶液來避免污染，而且速度更快，因為有數(shù)百種裝置可以同時運行。然而，并行裝置很難設(shè)計、制造和操作，并且容易因制造不完善或灰塵堵塞某些滴落器而發(fā)生故障。合成的乳液通常缺少庫中的關(guān)鍵試劑，并且含有大的、多分散的液滴，因此不適合進一步使用。因此，從數(shù)百種不同試劑中生成單分散液滴庫仍然是將液滴微流體應用于組合應用的主要障礙。
 

圖1。自動液體處理和分配，使用商用空氣滴式打印機生成單分散液滴庫。（a）通過在三步循環(huán)中操作打印機的毛細管噴嘴，對每個樣品進行乳化。1.噴嘴移動到清洗盤，噴嘴中先前的內(nèi)容物被彈出；2.噴嘴移動到樣品板上，吸入幾微升樣品；3.噴嘴移動到油浴中，將液滴噴射到油浴中，然后移動到清洗盤。（b）以這種方式生成的液滴庫是單分散的，類似于微流控裝置生成的液滴庫。

在這篇文章中，我們描述了一種簡單而快速的生成高多樣性液滴庫的方法。我們的方法使用Scienion SciFlexArrayer，一種設(shè)計用于將液滴打印到固體基底上的儀器。相反，我們使用它將液滴分配到一個表面活性劑負載的油浴中，從而生成穩(wěn)定的單分散液滴。由于該儀器是為商業(yè)用途而設(shè)計的，因此它具有生成庫的吸引人的功能，包括與微孔板吸樣區(qū)的自動對接和換樣時噴頭表面的嚴格清洗。壓電液滴發(fā)生器是可控的，允許產(chǎn)生50至800 pL的液滴體積。它的速度很快，可產(chǎn)生高達500 Hz的單分散液滴，因此只需幾小時即可產(chǎn)生數(shù)百種試劑的數(shù)百萬液滴。液滴生成是按需進行的，允許定義最終庫中每種試劑的準確比例。該儀器還可以執(zhí)行通常需要微流控設(shè)備和相關(guān)專業(yè)知識的分析。作為一個例子，我們使用它來進行數(shù)字PCR，盡管其他用于酶篩選、單細胞分析和分析物定量的分析是可行的。這種生成高多樣性液滴庫方法的速度、可靠性和易用該使組合應用程序更容易使用。

我們使用這種方法來執(zhí)行數(shù)字液滴PCR（ddPCR），這是一種普遍存在且重要的應用，通常需要微流體。進行液滴分析時的一個重要考慮因素是不同溶液的流體性質(zhì)對液滴生成的影響。當使用我們的標準參數(shù)為ddPCR生成液滴時，我們發(fā)現(xiàn)平均直徑相對于水滴增加了23%，變異系數(shù)為4.4%。如果需要，可以通過調(diào)整生成參數(shù)（例如脈沖幅度和寬度），將不同成分的液滴調(diào)整到所需的尺寸。在我們的ddPCR分析中，我們使用ΦX174病毒作為示例靶標，產(chǎn)生不同濃度的液滴來表征動態(tài)范圍和準確性。與陰性對照組相比，當病毒存在時，我們觀察到熒光液滴（圖4d），獲得對應于陰性液滴和陽性液滴的雙峰分布（圖4e）。因為我們以有限稀釋度裝載病毒，所以封裝遵循泊松統(tǒng)計。我們使用泊松估計器將每個液滴的DNA分子數(shù)量與陽性液滴的百分比聯(lián)系起來（圖4f)。這表明，使用SciFlexArrayer進行的ddPCR與使用常規(guī)微流體進行的反應類似。此外，它還說明了這種方法在沒有微流控專業(yè)知識的情況下進行液滴反應的前景。