巨噬細胞RAW264.7培養(yǎng)經(jīng)驗分享
巨噬細胞屬免疫細胞，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象，RAW264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）就是科學實驗中常用到的細胞系，其來源為雄性Abelson鼠科白血病病毒誘導的腫瘤。RAW264.7培養(yǎng)有許多注意事項，在培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)細胞形態(tài)改變（長出偽足）、消化困難、生長緩慢等問題。由于細胞的生長狀態(tài)對實驗數(shù)據(jù)是存在較大影響的，所以今天就來和大家分享一下RAW264.7細胞培養(yǎng)的經(jīng)驗。
一、細胞的形態(tài)與特點
RAW264.7細胞一般為圓形或橢圓形，小而透亮。因為其具有較強的吞噬能力，并在吞噬抗原后釋放趨化因子，促使細胞分化出偽足，粘附攀爬能力也因此增強。若細胞吞噬抗原過多、培養(yǎng)環(huán)境惡劣就會促使細胞呈現(xiàn)出梭形、長梭形，鏡下觀察就會發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)變?yōu)樗笮吻颐娣e變大，不再是具有細長偽足的類圓形小細胞。這也是出現(xiàn)消化困難的一個主要原因。
二、培養(yǎng)注意事項
1、由于RAW264.7細胞易有不同形態(tài)，傳代時就會發(fā)現(xiàn)形態(tài)變?yōu)樗笮蔚募毎茈y消化下來，輕敲培養(yǎng)皿細胞不會脫落，用力吹打又容易對細胞產(chǎn)生較大損傷，因此要盡量避免細胞發(fā)生形態(tài)改變。即在接種細胞時保持一個適中的傳代密度，避免其向終末細胞分化，因為一旦細胞發(fā)生分化變?yōu)殚L形是無法恢復的，這是培養(yǎng)RAW264.7細胞時最需要注意的問題。
2、RAW264.7細胞喜歡連片生長，正常狀態(tài)下應該是一小片一小片的分布在培養(yǎng)皿中，片片之間不相連接，等到長到更多更密的時才會連成大片，但同時也會疊加成層，容易出現(xiàn)部分細胞飄起無法貼壁的問題。所以，要關注好細胞的匯合程度，控制好細胞的生長速度，不能等到疊加成層時才去傳代。
3、RAW264.7細胞傳代后貼壁時間較短，半小時左右絕大部分細胞就能夠貼下去，剛貼壁時細胞呈圓形，折光度很好，鏡下觀察如小珍珠狀一個個地散落于培養(yǎng)皿中。生長一段時間后，部分細胞會變成類似四角形，伸出偽足之類的。這個時候就是在提醒你注意傳代了，此時無論匯合度如何都需要進行傳代了，因為形態(tài)發(fā)生改變的細胞對實驗結果會產(chǎn)生較大影響，最終造成實驗數(shù)據(jù)不理想。
三、復蘇、培養(yǎng)、傳代和凍存
復蘇：從液氮罐中取出細胞轉移至-80℃冰箱平衡溫度，準備15mL離心管根據(jù)需求加入適量預熱過的完全培養(yǎng)基（細胞凍存懸液：完全培養(yǎng)基=1:6），37℃水浴鍋孵育，復溫后吸出細胞懸液至15ml離心管，離心去除凍存上清后，根據(jù)細胞量用新鮮培液重懸，轉移至合適大小的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，第二天換液。
培養(yǎng)：DMEM-HD+ 10% FBS；5% CO2 ，37.0°C
傳代：去除培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基，滴加1×PBS清洗一遍，去除PBS，加胰酶消化，隨時觀察消化程度，加入完全培養(yǎng)基終止消化（胰酶：完全培養(yǎng)基=1:2），收集細胞懸液離心（一般為1100轉,4分鐘），去除上清，根據(jù)需求確定傳代比例（約1:3～1：6傳代/3d），用新鮮培養(yǎng)基輕柔吹打重懸，鋪回皿中晃勻。
凍存：無血清凍存液，直接放至在-80℃冰箱，注意受冷要均勻，第二天轉入液氮。
四、具體解決方案
在培養(yǎng)RAW264.7細胞的過程中容易遇到的問題主要包括以下幾種：
1. 復蘇后存活率不高
2. 細胞形態(tài)發(fā)生變異
3. 不同形態(tài)細胞消化時間不等
4. 細胞生長速度緩慢
當你遇到類似問題時，可嘗試以下幾種解決方案。
1.復蘇后存活率不高
原因： RAW264.7細胞不同生長密度下細胞形態(tài)不同，若復蘇密度太高，細胞增殖過快，會加劇細胞的營養(yǎng)缺失，加速細胞老化；若復蘇密度太低，細胞生長緩慢。
解決辦法： 直徑10cm的培養(yǎng)皿復蘇細胞，細胞數(shù)量控制在1.0×106~1.5×106個
2.細胞形態(tài)發(fā)生變異
原因： RAW264.7細胞的培養(yǎng)環(huán)境惡劣或吞噬過多抗原后會促使該細胞呈現(xiàn)梭形、長梭形，形態(tài)發(fā)生變化。
解決辦法： 改善細胞培養(yǎng)環(huán)境，例如與細胞接觸的器皿保證無菌，使用質量較高的胎牛血清。
3.不同形態(tài)細胞消化時間不等
原因： 細胞老化后，形態(tài)發(fā)生變化，細胞偽足變得多且長，這使得這種形態(tài)的細胞變得較難消化，使用胰酶長時間消化又會對細胞產(chǎn)生較大損傷。
解決辦法： 可在正常時間終止消化，收集大部分正常狀態(tài)的細胞，再加入新的胰酶繼續(xù)消化，而偽足過多過長的細胞，即使加胰酶消化10min及以上也是難以消化下來的，勉強消化下來，對后續(xù)的實驗數(shù)據(jù)也會產(chǎn)生較大影響，即沒必要每次傳代都收集全部細胞，已經(jīng)發(fā)生分化的細胞無需保留要及時丟棄。
4.細胞生長速度緩慢
原因： 傳代時匯合度過低會導致細胞生長緩慢，甚至難以貼壁，或是細胞發(fā)生了支原體污染。
解決辦法： 定期傳代，控制好傳代比例，匯合度不可過低。及時進行支原體檢測，如發(fā)現(xiàn)污染，即刻使用支原體去除試劑進行清除。
1. 復蘇后存活率不高
2. 細胞形態(tài)發(fā)生變異
3. 不同形態(tài)細胞消化時間不等
4. 細胞生長速度緩慢
當你遇到類似問題時，可嘗試以下幾種解決方案。
1.復蘇后存活率不高
原因： RAW264.7細胞不同生長密度下細胞形態(tài)不同，若復蘇密度太高，細胞增殖過快，會加劇細胞的營養(yǎng)缺失，加速細胞老化；若復蘇密度太低，細胞生長緩慢。
解決辦法： 直徑10cm的培養(yǎng)皿復蘇細胞，細胞數(shù)量控制在1.0×106~1.5×106個
2.細胞形態(tài)發(fā)生變異
原因： RAW264.7細胞的培養(yǎng)環(huán)境惡劣或吞噬過多抗原后會促使該細胞呈現(xiàn)梭形、長梭形，形態(tài)發(fā)生變化。
解決辦法： 改善細胞培養(yǎng)環(huán)境，例如與細胞接觸的器皿保證無菌，使用質量較高的胎牛血清。
3.不同形態(tài)細胞消化時間不等
原因： 細胞老化后，形態(tài)發(fā)生變化，細胞偽足變得多且長，這使得這種形態(tài)的細胞變得較難消化，使用胰酶長時間消化又會對細胞產(chǎn)生較大損傷。
解決辦法： 可在正常時間終止消化，收集大部分正常狀態(tài)的細胞，再加入新的胰酶繼續(xù)消化，而偽足過多過長的細胞，即使加胰酶消化10min及以上也是難以消化下來的，勉強消化下來，對后續(xù)的實驗數(shù)據(jù)也會產(chǎn)生較大影響，即沒必要每次傳代都收集全部細胞，已經(jīng)發(fā)生分化的細胞無需保留要及時丟棄。
4.細胞生長速度緩慢
原因： 傳代時匯合度過低會導致細胞生長緩慢，甚至難以貼壁，或是細胞發(fā)生了支原體污染。
解決辦法： 定期傳代，控制好傳代比例，匯合度不可過低。及時進行支原體檢測，如發(fā)現(xiàn)污染，即刻使用支原體去除試劑進行清除。
標簽：
細胞培養(yǎng)
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