間充質干細胞（MSC）成軟骨誘導分化的操作講解
在大多數(shù)干細胞實驗研究中，誘導分化成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞已經成為鑒定其分化潛能的金標準。
前面我們已經分享了成骨誘導分化、成脂誘導分化的操作，本期來到三系分化的最后一站——成軟骨誘導分化操作講解！
成軟骨誘導分化
軟骨的破壞、缺失是骨關節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）在內的多種骨科疾病的重要病理改變。由于軟骨特殊的解剖及組織特性，如缺乏血管和淋巴管的分布，使得其自我修復能力異常不足，因此通過人工方法修復軟骨破壞具有重要臨床意義。
近年來，隨著間充質干細胞（MSC）的發(fā)現(xiàn)和研究深入，其來源廣泛、良好的增殖能力、多分化潛能、與各種3D支架材料具有良好的生物相容性等優(yōu)良特性，使得其在軟骨修復應用中具有令人期待的應用潛力。
MSC成軟骨分化的過程：
MSC首先收回其突起，聚集成團，這個團中間的細胞經分裂分化轉變成一種大而圓的細胞，即成軟骨細胞；成軟骨細胞產生基質和纖維（主要為II型膠原蛋白），當基質的量增加到一定程度時，成軟骨細胞被分隔在陷窩內，分化為成熟的軟骨細胞。
體外誘導成軟骨分化的鑒定
主要是形態(tài)學觀察、阿利辛藍染色，以及檢測成軟骨的標志物——II型膠原蛋白來進行，包括通過免疫組化、Western Blot檢測II型膠原蛋白的表達，以及RT-PCR檢測II型膠原蛋白的mRNA的表達等不同的角度進行鑒定；而阿利辛藍則主要檢測成軟骨細胞內酸性粘多糖。
OriCell® 間充質干細胞成軟骨誘導分化阿利辛藍染色效果
實操走起
所需材料
● OriCell® 間充質干細胞成軟骨誘導分化試劑盒（套裝內含基礎培養(yǎng)基、成軟骨誘導添加物、阿利辛藍染色液）
● 4%多聚甲醛溶液或10%福爾馬林溶液
實驗操作步驟
1. 將3~4×105個待誘導細胞轉移到15mL離心管中，20℃，250×g離心4min。
2. 吸去上清。加入0.5 mL成軟骨誘導分化預混液，重懸上一步離心所得沉淀，20℃，150×g 離心 5min。
3. 重復步驟2，再次清洗細胞。
4. OriCell® 間充質干細胞成軟骨誘導分化添加物II（以下簡稱添加物II）的添加，按照比例（1mL成軟骨誘導分化預混液中加入10μL添加物II），吸取實驗所需劑量的添加物II，加入相應體積的預混液中配制成成軟骨誘導分化完全培養(yǎng)基，輕柔吹打混勻。
5. 將步驟3所得細胞沉淀用0.5mL成軟骨誘導分化完全培養(yǎng)基重懸，20℃，150×g離心5 min。
6. 擰松離心管蓋以便于氣體交換。將其豎立放置于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
7. 當細胞團出現(xiàn)聚團現(xiàn)象時（一般為 24 h 或 48 h 后，視實際情況而定），輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中。
8.自接種開始計算，每隔2~3 d給細胞換用新鮮的成軟骨誘導分化完全培養(yǎng)基，每管約0.5mL。
9.持續(xù)誘導，直至管內形成直徑1.5~2 mm的軟骨球，即可準備切片染色。
注意事項
1、吸取添加物II之前需短暫離心試劑管，使試劑聚集于管底以便取用。
2、務必將添加物II分裝保存在-20℃以下，避免反復凍融，可保存12個月。
3、加入添加物II的成軟骨誘導分化完全培養(yǎng)基務必現(xiàn)配現(xiàn)用，4℃保存不可超過12h。
4、步驟6不需要吸去上清或重懸細胞；24h之內不要晃動離心管。
5、步驟8，每次更換培養(yǎng)基后，都需輕彈離心管，使軟骨球脫離管底懸浮在液體中；且更換培養(yǎng)基后務必擰松離心管蓋再放入培養(yǎng)箱中。
軟骨球切片染色操作步驟
注意：本步驟以石蠟切片染色為例。若使用冰凍切片，請遵照切片機使用規(guī)程。
1. 固定。誘導形成的軟骨球用1×PBS清洗后，浸泡于4%多聚甲醛溶液（或10%福爾馬林溶液），固定30min以上。注意：固定液需現(xiàn)配現(xiàn)用。
2. 脫水。固定好的軟骨球使用梯度濃度酒精脫水，方式如下，每一階段30 min。
50%酒精→70%酒精→80%酒精→95%酒精→無水酒精
注意：
1）脫水必須在有蓋的容器中進行，防止吸收空氣中的水分；
2）軟骨球不要在酒精中浸泡太久，易碎裂；
3）在更換酒精時，可吸出低濃度酒精，再加入高濃度酒精。避免移動增加軟骨球碎裂的風險。
3. 透明。因酒精和石蠟不相溶，所以脫水后需經二甲苯過渡。方式如下：
- 二甲苯和無水酒精按體積比 1:1 混勻。將軟骨球浸泡其中 2 h。
- 將軟骨球浸泡在純二甲苯中 1.5 h。
- 更換新的二甲苯，繼續(xù)浸泡 1 h。
注意：
1）透明必須在有蓋的容器中進行，防止吸收空氣中的水分；
2）透明過程中，如果軟骨球周圍出現(xiàn)白色霧狀氣泡，說明其中水未被脫凈。應重新放回酒精中脫水再透明。
4. 浸蠟。為了除去軟骨球中的透明劑，使石蠟滲透到內部以便包埋，需要浸蠟處理。
- 二甲苯和石蠟按體積比 1:1 混勻。將軟骨球浸泡其中，再一起放置于 40℃烘箱中 40 min。
- 將軟骨球浸泡在純石蠟中，放置于 55℃烘箱中 30 min。
注意：1）浸蠟盡量保持在較低溫度中進行，石蠟不凝固即可；
2）溫度要恒定，不可忽高忽低。
5. 包埋。將軟骨球取出，置于模具中。倒入石蠟，靜置冷卻。待石蠟充分冷卻成形，取出，修整蠟塊。
6. 切片。連續(xù)切片，每片厚度 3 μm。
7. 粘片。將軟骨球切片用粘貼劑粘附于載玻片上，在 35℃烘箱中烘干。
8. 脫臘。
- 純二甲苯浸泡切片 15 min，更換新的二甲苯浸泡切片 10 min。
- 二甲苯和無水酒精按體積比 1:1 混勻。浸泡切片 10 min。
- 依次使用 95%、85%、70%、50%酒精浸泡切片 10 min，晾干。
9. 染色。
- 在晾干的切片上滴加阿利辛藍，37℃染色 1 h。
- 用自來水沖洗載玻片 5 min，晾干。
10. 顯微鏡下觀察阿利辛藍染色效果。阿利辛藍染色部分顯示的是軟骨組織中的內酸性粘多糖。
